استخراج RNA از باکتری

RNA  یا اسید ریبونوکلئیک ، نوعی از اسید نوکلئیک می باشد که از نظر ساختاری به DNA شباهت دارد اما به روش های ظریفی متفاوت است. دو تفاوت عمده متمایز کننده  DNA از RNA عبارت است از : (الف) RNA حاوی قند ریبوز می باشد ، در حالی که DNA حاوی قند کمی متفاوت دئوکسی ریبوز است (نوعی از ریبوز که فاقد یک اتم اکسیژن است) و (ب) RNA دارای باز اوراسیل و DNA حاوی باز تیمین می باشد.  RNA بر خلاف DNA  تک رشته ای می باشد. RNA تک رشته ای ، دارای ستون فقراتی از گروه های قند (ریبوز) و فسفات متناوب می باشد. به هرکدام از قند ها یکی از چهار باز : آدنین (A)، اوراسیل (U)، سیتوزین (C) یا گوانین (G) متصل است. سلول از RNA ها برای تعدادی از وظایف مختلف استفاده می کند ، که یکی از آن ها RNA پیام رسان یا mRNA نامیده می شود که در واقع ، مولکول اطلاعاتی اسید نوکلئیک می باشد که با ترجمه ، اطلاعات را از ژنوم به پروتئین ها منتقل می کند. شکل دیگری از RNA ، tRNA یا RNA انتقالی است ، که مولکول‌های RNA کدکننده غیرپروتئینی هستند ، که به طور فیزیکی آمینو اسیدها را به محل ترجمه حمل می‌کنند و به آن ها اجازه می‌دهد تا در زنجیره‌ای از پروتئین‌ها در فرآیند ترجمه تجمع یابند. اخیراً مشخص شده است که برخی از RNA های کوچک در تنظیم بیان ژن نقش دارند. اگرچه مولکول های RNA در هسته سلول ، جایی که DNA در آن قرار دارد ، سنتز می شوند ، اما بیشتر آن ها قبل از انجام وظایف خود به سیتوپلاسم منتقل می شوند. در واقع ،  ژنتیک مولکولی از این درک پدید آمده است که ، DNA و RNA ماده ژنتیکی تمام موجودات زنده را تشکیل می دهند.

ماده ژنتیکی باکتری ها و پلاسمیدها DNA می باشد. ویروس های باکتریایی (باکتریوفاژها یا فاژها) دارای DNA یا RNA به عنوان ماده ژنتیکی هستند. باکتری ها موجودات پروکاریوتی هستند ، به این معنی که ارگانیسم های اولیه و بدون هسته می باشند. باکتری ها هسته متصل به غشاء ندارند . اجزای هسته ای آن ها یا به صورت پراکنده در سیتوپلاسم  و یا در قسمتی از باکتری به نام نوکلوئید یافت می شوند. نوکلوئید حاوی کروموزوم با پروتئین های مرتبط و RNA است. در واقع ، باکتری ها نیز همانند یوکاریوت ها ، حاوی RNA و DNA می باشند. محتوای RNA و تشکیل یک سلول باکتریایی به شدت به نوع باکتری و وضعیت رشد و فیزیولوژیک سلول بستگی دارد. هم پروکاریوت ها و هم یوکاریوت ها RNA های ریبوزومی و انتقالی خود را پردازش می کنند. در سلول های یوکاریوتی ، سنتز RNA که در هسته اتفاق می افتد ، از دستگاه سنتز پروتئین که در سیتوپلاسم است جدا می باشد. رونویسی و ترجمه پروکاریوتی به طور همزمان در سیتوپلاسم اتفاق می افتد و تنظیم در سطح رونویسی اتفاق می افتد. بیان مواد ژنتیکی تحت مجموعه خاصی از شرایط رشد ، مشخصه های قابل مشاهده (فنوتیپ) ارگانیسم را تعیین می کند. باکتری‌ها ویژگی‌های ساختاری یا رشدی کمی دارند که می‌توان آن ها را به راحتی مشاهده کرد ، اما دارای طیف وسیعی از قابلیت‌های بیوشیمیایی و الگوهای حساسیت به عوامل ضد میکروبی یا باکتریوفاژها هستند. این ویژگی های اخیر اغلب به عنوان صفات ارثی برای تجزیه و تحلیل در مطالعات ژنتیک باکتری استفاده می شوند.

پروکاریوت ها به ازای miRNA ، دارای مجموعه قابل توجهی از RNA های تنظیمی کوچک (sRNA) هستند که مشابهی در یوکاریوت ها ندارند. پروکاریوت ها با یوکاریوت ها در فقدان هسته تفاوت دارند. در نتیجه ، بسیاری از مولکول های RNA که در داخل هسته عمل می کنند ، در پروکاریوت ها وجود ندارند. sRNA ها در باکتری ها با مکانیسم های متنوعی تکامل یافته اند ، تا بتوانند بیان ژن هدف خود را در پاسخ به تغییرات محیطی متعادل کنند. مطالعات روی فرآیندهای تنظیمی باکتریایی به طور محکم ثابت کرده است که sRNA ها بیان ژن هدف خود را به طور کلی پس از رونویسی تعدیل می کنند. در واقع sRNA  ها ، RNAهای کوچکی هستند که توسط باکتری ها تولید می شوند. آن ها مولکول های RNA غیر کد کننده 50 تا 500 نوکلئوتیدی هستند که ساختار بالایی دارند و حاوی چندین  حلقه – ساقه (stem-loops) هستند. sRNA های متعددی با استفاده از آنالیز محاسباتی و تکنیک های آزمایشگاهی مانند نورترن بلات (Northern blotting) ، ریزآرایه ها (microarrays) و RNA-Seq در تعدادی از گونه های باکتریایی از جمله اشریشیا کلی (Escherichia coli) ، پاتوژن مدل سالمونلا ، سیانوباکترهای دریایی ، استرپتو کوکوس پیوژنز، پاتوژن استافیلوکوکوس اورئوس ، فرانسیسلا تولارنسیس (عامل ایجاد تولارمی) ، شناسایی شده اند.

sRNA های باکتری دارای مکانیسم های تنظیمی بسیار متنوعی هستند. به طور کلی ، sRNA ها می توانند به اهداف پروتئینی متصل شوند و عملکرد پروتئین متصل را تغییر دهند. متناوبا ، sRNA ها ممکن است با اهداف mRNA تعامل داشته باشند و بیان ژن را با اتصال به mRNA مکمل و مسدود کردن ترجمه ، یا با باز کردن یا مسدود کردن محل اتصال ریبوزوم تنظیم کنند. sRNA های باکتری بر نحوه بیان ژن ها در سلول های باکتریایی ، از طریق تعامل با mRNA یا پروتئین تأثیر می گذارد و بنابراین می توانند بر انواع عملکردهای باکتری مانند متابولیسم ، حدت ، پاسخ به استرس محیطی و ساختار تأثیر بگذارند.

پروکاریوت ها از سیستم CRISPR برای دفاع ضد ویروسی استفاده می کنند در حالی که یوکاریوت ها به تداخل RNA متکی هستند. در نتیجه ، پروکاریوت ها دارای RNA های مرتبط با سیستم CRISPR هستند ، اما فاقد آن هایی هستند که در RNAi   (siRNA و piRNA) شرکت می کنند.همان طور که در بالا اشاره شد ، پروکاریوت‌ها فاقد miRNA هستند ، که منشأ تکاملی با siRNA دارد و توسط مکانیسم مرتبط تولید می‌شود. بسیاری از مولکول های RNA ای که در داخل هسته عمل می کنند ، در پروکاریوت ها وجود ندارند. فقدان هسته (در پروکاریوت ها) ، همراه با ژنوم‌های کوچک ‌تر با مناطق درون ‌ژنی کوتاه ، به این معنی است که پروکاریوت‌ها فاقد اکثر RNA های طولانی غیرکد کننده (lncRNA) و اشکال مرتبط RNA  تقویت‌کننده  (eRNA)، RNA  دایره‌ای  (circRNA) و غیره هستند. بسیاری از کلاس های RNA که در هسته یوکاریوتی عمل می کنند ، به ویژه snRNA و  snoRNA، که در پیرایش و اصلاح RNA شرکت می کنند ، در پروکاریوت ها دیده نمی شوند. در نهایت ، پروکاریوت ها حاوی تعداد انگشت شماری از RNA های تخصصی هستند که در یوکاریوت ها وجود ندارند. از جمله این RNA های اختصاصی  می توان  به RNA 6S که تنظیم کننده رونویسی است و tmRNA که ریبوزوم های متوقف شده را نجات می دهد ، اشاره کرد. علاوه بر این ، سوئیچ‌های ریبوز ( riboswitches) که در انتهای ′5 mRNA قرار دارند ، در پروکاریوت‌ دیده می شوند ، اما در یوکاریوت‌ها بسیار نادر هستند. در مقابل ، یوکاریوت ها اغلب بیان mRNA را با اتصال miRNA به ناحیه ترجمه نشده ′3 تنظیم می کنند. اینکه چرا یوکاریوت ها و پروکاریوت ها از انتهای مختلف mRNA برای تنظیمِ پس از رونویسی خود استفاده می کنند ، ناشناخته است. تا به حال تصور می شد که یوکاریوت ها و پروکاریوت ها در داشتن RNA کلاهدار متفاوت باشند. در حال حاضر مشاهده شده است که ، پوشش مورد نظر در پروکاریوت ها نیز دیده می شود.

به دست آوردن RNA با کیفیت بالا اولین و اغلب حیاتی ترین مرحله در انجام بسیاری از تکنیک های مولکولی مانند انواع PCR ،Real-time PCR، Next generation sequencing، Array analysis ،  و ساخت کتابخانه  cDNA ، برای ایجاد حساس‌ترین و مرتبط ‌ترین نتایج از نظر بیولوژیکی می باشد .

روش های جداسازی RNA از باکتری ها شامل لیز کردن سلول ها و به دنبال آن مراحل جداسازی RNA از DNA و پروتئین آلوده کننده است.

به طور کلی روش های مختلفی برای جداسازی و استخراج RNA از هر دو گونه های باکتری های گرم منفی و گرم مثبت وجود دارد.اکثر روش‌های سنتی خالص‌سازی RNA در حضور عوامل بازدارنده RNase (معمولاً دناتوره‌کننده‌های قوی مانند نمک‌های گوانیدین، سدیم دودسیل سولفات (SDS)) یا ترکیبات مبتنی بر فنل که برای کاهش خطر تخریب RNA در نمونه طراحی شده‌اند انجام می‌شود.سه تکنیک اصلی به طور گسترده برای استخراج RNA استفاده می شود: استخراج آلی، مانند محلول های مبتنی بر فنل-گوانیدین ایزوتیوسیانات (GITC)، فناوری ستون چرخشی مبتنی بر غشای سیلیسی، و فناوری ذرات پارامغناطیس.

یکی از متداول ترین روش های مورد استفاده، استخراج آلی مبتنی بر فنل-GITC است. محلول ترایزول(YTzol pure RNA) یک محلول مونوفازی متشکل از فنول و گوانیدین ایزوتیوسانات است. سلول های باکتری در این ماده ابتدا حل می شود و پس از اضافه کردن کلروفورم محلول به فاز آبی و ارگانیک تقسیم می شود. RNA در فازآبی قرار دارد و به واسطه ایزوپروپانول الکل  رسوب داده می شود. با این حال، نمونه های RNA جدا شده با این روش اغلب با پروتئین ها و سایر مواد سلولی، حلال های آلی مانند فنل-کلروفرم، نمک ها و اتانول آلوده می شوند. علاوه بر این، این روش‌ها نیازمند اقدامات احتیاطی ایمنی (به عنوان مثال، استفاده از هودهای بخار) هستند که این روش را طولانی‌تر می‌کند و از استخراج مایع-مایع استفاده می‌کند که منجر به جداسازی ناقص فازها و افزایش آلودگی انتقالی با DNA ژنومی می‌شود. ستون سیلیس و سیستم های جداسازی RNA مبتنی بر ذرات پارامغناطیس نیازی به استفاده از حلال های آلی سمی ندارند، نسبتا ساده، کارآمد، کم هزینه هستند و RNA دست نخورده کامل را با سطوح پایین آلودگی از پروتئین ها و سایر مواد سلولی تولید می کنند. با این حال، این روش ها اغلب می توانند منجر به ایجاد آلودگی DNA ژنومی شوند.

هضم با  DNase ، آثار DNA را حذف می‌کند و اگر نمونه‌های RNA برای استفاده در RT-qPCR باشد، لازم است از این هضم آنزیمی استفاده شود. تکنیک های بیولوژیکی مولکولی مختلفی به RNA با کیفیت بالاو اساساً عاری از DNA، باغلظت بالا نیاز دارند.

جداسازی RNA از باکتری ها به دلیل ناپایداری و آسیب پذیری RNA ، از نظر فنی دشوار است. محلول های زیادی برای لیز سلولی و مهار کامل RNase مورد بررسی قرار گرفتند. با این حال، روش‌های موجود برای جداسازی RNA یا با راندمان پایین یا زمان‌بر هستند. جداسازی اسید نوکلئیک به طور منظم نقطه شروع برای همه کاربردهای پایین دست است. برای غلبه بر مشکلات موجود در روش های رایج، روش‌های استخراج قابل اعتماد مانند کیت‌های استخراج RNA تجاری و حلال‌های آلی RNA با کیفیت بالا از انواع مختلف نمونه‌ها از جمله رده‌های سلولی، بافت‌های گیاهی و پستانداران، باکتری‌ها، ویروس‌ها و غیره تولید می‌کنند.

جهت استخراج RNA از باکتری اینجا کلیک کنید.

سوالات متداول