کنترل کیفیت DNA استخراج‌شده؛ ۴ معیار مهم برای بررسی کیفیت DNA

استخراج DNA زمانی موفق محسوب نمی‌شود که فقط مقدار مناسبی DNA به دست آمده باشد. برای استفاده از DNA در آزمایش‌هایی مانند PCR، Real-Time PCR، کلونینگ، تعیین توالی، ژنوتایپینگ و NGS باید کیفیت نمونه نیز بررسی شود.

کنترل کیفیت DNA به ما کمک می‌کند مشخص کنیم DNA استخراج‌شده از نظر مقدار، خلوص و سلامت مولکولی در چه وضعیتی قرار دارد و آیا برای آزمایش موردنظر مناسب است یا خیر.

به‌طور کلی، چهار معیار مهم در بررسی کیفیت DNA عبارت‌اند از:

1. غلظت DNA
2. نسبت A260/A280
3. نسبت A260/A230
4. یکپارچگی DNA یا DNA Integrity

این معیارها اطلاعات یکسانی ارائه نمی‌کنند. غلظت، مقدار DNA موجود در نمونه را نشان می‌دهد؛ A260/A280 و A260/A230 بیشتر برای بررسی خلوص و احتمال وجود برخی آلودگی‌ها استفاده می‌شوند و DNA Integrity مشخص می‌کند DNA تا چه اندازه سالم و کم‌تخریب باقی مانده است.

بنابراین ممکن است یک نمونه DNA مقدار زیادی داشته باشد و از نظر برخی شاخص‌های خلوص نیز مناسب به نظر برسد، اما به دلیل تخریب یا شکستگی DNA برای یک کاربرد خاص مناسب نباشد.

۴ معیار کلیدی برای بررسی کیفیت DNA پس از استخراج

۱. غلظت DNA؛ چه مقدار DNA در اختیار داریم؟

اولین مرحله در کنترل کیفیت DNA، بررسی غلظت DNA استخراج‌شده است.

غلظت مشخص می‌کند چه مقدار DNA در حجم مشخصی از نمونه وجود دارد و آیا مقدار آن برای آزمایش بعدی کافی است یا خیر.

اندازه‌گیری غلظت DNA معمولاً با ابزارهایی مانند NanoDrop، اسپکتروفتومتر یا Qubit انجام می‌شود.

آیا غلظت بالای DNA به معنی کیفیت خوب است؟

خیر.

غلظت بالا فقط نشان می‌دهد مقدار قابل‌توجهی ماده قابل‌اندازه‌گیری در نمونه وجود دارد و به‌تنهایی نمی‌تواند خلوص یا سلامت DNA را مشخص کند.

برای مثال، اگر DNA استخراج‌شده همراه با RNA، پروتئین یا سایر مواد مزاحم باشد، ممکن است اندازه‌گیری جذب نوری مقدار DNA را بیشتر از مقدار واقعی نشان دهد.

از طرف دیگر، یک نمونه با غلظت کمتر می‌تواند از نظر خلوص و یکپارچگی برای آزمایش موردنظر وضعیت مناسبی داشته باشد.

بنابراین:

غلظت DNA مقدار نمونه را نشان می‌دهد، نه کیفیت کامل آن را.

NanoDrop یا Qubit؛ کدام روش برای اندازه‌گیری DNA بهتر است؟

NanoDrop یکی از روش‌های رایج برای ارزیابی اولیه DNA است. این دستگاه علاوه بر تخمین مقدار DNA، نسبت‌های جذب و اطلاعاتی درباره خلوص نمونه ارائه می‌دهد.

Qubit بر پایه فلورومتری کار می‌کند و برای کمی‌سازی اختصاصی‌تر DNA بسیار کاربردی است. این ویژگی به‌خصوص زمانی اهمیت پیدا می‌کند که مقدار DNA کم باشد یا وجود سایر مواد بتواند اندازه‌گیری جذب نوری را تحت تأثیر قرار دهد.

بنابراین این دو ابزار الزاماً جایگزین یکدیگر نیستند.

می‌توان از NanoDrop برای بررسی اولیه مقدار و خلوص و از Qubit برای کمی‌سازی اختصاصی‌تر DNA استفاده کرد.

یک نکته مهم این است که Qubit به‌تنهایی اطلاعاتی درباره A260/A280 یا A260/A230 ارائه نمی‌دهد؛ این شاخص‌ها با روش‌های مبتنی بر جذب نوری بررسی می‌شوند.

۲. نسبت A260/A280؛ یکی از شاخص‌های خلوص DNA

یکی از رایج‌ترین معیارها در کنترل کیفیت DNA، نسبت A260/A280 است.

این نسبت بر اساس مقایسه جذب نمونه در 260 و 280 نانومتر محاسبه می‌شود و می‌تواند اطلاعاتی درباره خلوص DNA و احتمال وجود برخی مواد همراه نمونه ارائه کند.

از آنجا که اسیدهای نوکلئیک و بسیاری از پروتئین‌ها رفتار جذب متفاوتی دارند، A260/A280 به‌عنوان یک شاخص اولیه برای بررسی خلوص DNA کاربرد دارد. Illumina نیز از این نسبت به‌عنوان یکی از معیارهای ارزیابی خلوص DNA در workflowهای خود استفاده می‌کند.

A260/A280 پایین چه معنایی دارد؟

اگر این نسبت پایین‌تر از محدوده مورد انتظار باشد، احتمال وجود موادی مانند:

• پروتئین
• برخی ترکیبات همراه نمونه
• باقی‌مانده‌های ناشی از فرآیند استخراج

بیشتر می‌شود.

البته یک نسبت پایین به‌تنهایی نمی‌تواند نوع آلودگی را مشخص کند. نوع نمونه، روش استخراج، محلول مورد استفاده و سایر نتایج QC نیز باید در نظر گرفته شوند.

آیا A260/A280 مناسب به معنی DNA سالم است؟

خیر.

A260/A280 بیشتر درباره یکی از جنبه‌های خلوص DNA اطلاعات می‌دهد و نمی‌تواند میزان شکستگی یا تخریب مولکول DNA را مشخص کند.

ممکن است DNA از نظر A260/A280 وضعیت مناسبی داشته باشد، اما به دلیل آسیب مکانیکی، شرایط نامناسب استخراج یا نگهداری، Integrity پایینی داشته باشد.

۳. نسبت A260/A230؛ بررسی آلودگی‌های باقی‌مانده از استخراج

A260/A230 یکی دیگر از شاخص‌های مهم برای بررسی خلوص DNA است.

این نسبت اطلاعات مکملی درباره وجود برخی مواد باقی‌مانده از فرآیند استخراج و خالص‌سازی ارائه می‌دهد.

موادی مانند:

• برخی نمک‌ها
• ترکیبات گوانیدین
• فنول
• برخی ترکیبات آلی
• بقایای بافرها
• برخی مواد باقی‌مانده از مراحل شست‌وشو

می‌توانند روی جذب ناحیه 230 نانومتر اثر بگذارند.

به همین دلیل، کاهش A260/A230 می‌تواند هشداری برای وجود مواد مزاحم در نمونه باشد.

چرا A260/A230 برای DNA اهمیت دارد؟

بعضی آلاینده‌های باقی‌مانده از فرآیند استخراج ممکن است در مراحل بعدی مانند:

PCR، آنزیم‌های محدودکننده، کلونینگ، واکنش‌های آنزیمی و library preparation

اختلال ایجاد کنند.

بنابراین ممکن است مقدار DNA مناسب باشد، اما کیفیت شیمیایی نمونه برای آزمایش پایین‌دستی مطلوب نباشد.

تفاوت A260/A280 و A260/A230 در DNA چیست؟

هر دو نسبت برای بررسی خلوص DNA استفاده می‌شوند، اما اطلاعات یکسانی ارائه نمی‌کنند.

بنابراین بهتر است این شاخص‌ها در کنار یکدیگر تفسیر شوند.

یک نمونه ممکن است A260/A280 مناسبی داشته باشد اما A260/A230 پایین باشد؛ در چنین شرایطی احتمال وجود برخی مواد باقی‌مانده از استخراج باید بررسی شود.

از طرف دیگر، هر دو نسبت ممکن است مناسب باشند ولی DNA به دلیل تخریب یا fragmentation برای کاربرد موردنظر مناسب نباشد.

۴. یکپارچگی DNA یا DNA Integrity؛ آیا DNA واقعاً سالم است؟

چهارمین معیار مهم در کنترل کیفیت DNA، یکپارچگی یا DNA Integrity است.

در این مرحله سؤال اصلی این است:

آیا مولکول‌های DNA استخراج‌شده هنوز بلند، سالم و نسبتاً دست‌نخورده هستند یا در اثر تخریب و شکستگی به قطعات کوچک‌تر تبدیل شده‌اند؟

این موضوع به‌خصوص برای DNA ژنومی اهمیت دارد.

DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا می‌تواند در اثر عوامل مکانیکی و شیمیایی به قطعات کوچک‌تر تبدیل شود. نمونه‌ای که در این شرایط از نظر غلظت مناسب است، الزاماً DNA با Integrity بالا ندارد.

چه عواملی باعث تخریب DNA می‌شوند؟

کیفیت DNA ممکن است در مراحل مختلف تحت تأثیر قرار گیرد.

برخی عوامل مهم عبارت‌اند از:

• استخراج نامناسب
• هم‌زدن شدید یا vortex کردن غیرضروری DNA ژنومی
• انتقال‌های مکرر نمونه
• نگهداری نامناسب
• چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب
• pH نامناسب
• فعالیت برخی آنزیم‌های تجزیه‌کننده DNA
• باقی‌ماندن مواد شیمیایی ناشی از استخراج
• آسیب‌های ایجادشده در نمونه اولیه

در DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا، آسیب مکانیکی اهمیت ویژه‌ای دارد؛ زیرا کشش و برش فیزیکی می‌تواند مولکول‌های بزرگ DNA را به قطعات کوچک‌تر تبدیل کند.

چگونه Integrity DNA را بررسی کنیم؟

روش انتخابی به نوع DNA و کاربرد نهایی بستگی دارد.

بررسی DNA روی ژل آگارز

یکی از ساده‌ترین روش‌های بررسی DNA، الکتروفورز روی ژل آگارز است.

DNA ژنومی سالم معمولاً به صورت یک سیگنال با وزن مولکولی بالا و نسبتاً فشرده نزدیک بخش بالایی ژل دیده می‌شود.

در DNA تخریب‌شده، مقدار بیشتری از DNA به شکل smear در محدوده گسترده‌ای از اندازه‌ها مشاهده می‌شود.

این روش برای مقایسه کیفی نمونه‌ها و مشاهده تخریب DNA بسیار مفید است، اما یک امتیاز استاندارد و عددی برای Integrity ارائه نمی‌کند.

TapeStation و DNA Integrity Number

برای ارزیابی دقیق‌تر DNA ژنومی می‌توان از سیستم‌هایی مانند Agilent TapeStation و کیت‌های اختصاصی Genomic DNA ScreenTape استفاده کرد.

این سیستم علاوه بر جداسازی و اندازه‌گیری DNA، شاخصی به نام:

DIN = DNA Integrity Number

ارائه می‌دهد.

DIN یک امتیاز استاندارد برای توصیف Integrity DNA ژنومی است و به توزیع DNA در محدوده‌های مختلف اندازه توجه می‌کند. Agilent این شاخص را برای QC نمونه‌های gDNA، از جمله نمونه‌های مورد استفاده در workflowهای NGS، ارائه می‌کند.

DIN چیست؟

DIN مخفف DNA Integrity Number است.

این شاخص برای بیان وضعیت یکپارچگی DNA ژنومی به شکل عددی استفاده می‌شود.

در سیستم‌های Agilent، DIN در مقیاسی از 1 تا 10 گزارش می‌شود و مقدار بالاتر نشان‌دهنده DNA با Integrity بهتر است.

به زبان ساده:

DIN بالا → DNA یکپارچه‌تر و کم‌تخریب‌تر

DIN پایین → DNA تخریب‌شده‌تر

البته مانند RIN در RNA، DIN نیز باید بر اساس نوع نمونه و کاربرد نهایی تفسیر شود و نباید به‌تنهایی مبنای پذیرش یا رد تمام نمونه‌ها قرار گیرد.

آیا DNA با Integrity پایین همیشه غیرقابل استفاده است؟

خیر.

مناسب بودن DNA به نوع آزمایش بستگی دارد.

برای مثال، DNA مورد استفاده در یک PCR معمولی ممکن است با DNAیی که برای Long-Read Sequencing یا برخی workflowهای NGS لازم است، نیازهای متفاوتی داشته باشد.

در بعضی آزمایش‌های PCR، کافی است ناحیه موردنظر در DNA سالم باقی مانده باشد.

اما در کاربردهایی که به قطعات بسیار بلند DNA یا DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا نیاز دارند، Integrity اهمیت بسیار بیشتری پیدا می‌کند.

Agilent نیز DNA ژنومی با کیفیت بالا را برای برخی کاربردهای پایین‌دستی مانند NGS و long-read sequencing اهمیت می‌دهد.

آیا DNA با خلوص مناسب می‌تواند Integrity پایینی داشته باشد؟

بله.

این موضوع یکی از مهم‌ترین نکات در کنترل کیفیت DNA استخراج‌شده است.

ممکن است یک نمونه از نظر A260/A280 و A260/A230 مناسب باشد، اما DNA آن در اثر تخریب یا شکستگی به قطعات کوچک‌تر تبدیل شده باشد.

در چنین شرایطی:

Purity مناسب ≠ Integrity مناسب

بنابراین برای DNA ژنومی مورد استفاده در کاربردهای حساس، بررسی Integrity می‌تواند به اندازه بررسی خلوص اهمیت داشته باشد.

یکپارچگی DNA برای چه کاربردهایی اهمیت بیشتری دارد؟

Integrity DNA به‌خصوص در کاربردهایی که به DNA با طول زیاد نیاز دارند اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.

برای مثال:

• NGS
• Whole Genome Sequencing
• Long-Read Sequencing
• برخی مطالعات ژنومی
• بانک‌های زیستی
• آماده‌سازی برخی libraryها

در چنین کاربردهایی، DNA تخریب‌شده ممکن است روی آماده‌سازی نمونه و کیفیت داده نهایی اثر بگذارد.

در مقابل، برای برخی PCRهای معمولی که هدف آن‌ها تکثیر یک قطعه نسبتاً کوتاه است، تخریب جزئی DNA ممکن است اثر کمتری داشته باشد.

بنابراین مانند هر شاخص QC دیگر، DNA Integrity باید متناسب با کاربرد نهایی تفسیر شود.

NanoDrop یا Qubit؛ برای کنترل کیفیت DNA کدام بهتر است؟

بهتر است این دو ابزار را مکمل یکدیگر در نظر بگیریم.

NanoDrop برای بررسی سریع مقدار و شاخص‌های خلوص مانند A260/A280 و A260/A230 مناسب است.

Qubit برای کمی‌سازی اختصاصی‌تر DNA مفید است.

Thermo Fisher تصریح می‌کند که Qubit برای تعیین مقدار DNA طراحی شده و به‌تنهایی A260/A280 یا آلودگی پروتئینی را اندازه‌گیری نمی‌کند؛ برای چنین بررسی‌هایی روش‌های مبتنی بر جذب نوری مانند NanoDrop کاربرد دارند.

بنابراین در یک Workflow کنترل کیفیت می‌توان از:

NanoDrop → بررسی مقدار و خلوص

و

Qubit → کمی‌سازی اختصاصی‌تر

استفاده کرد.

آلودگی RNA در DNA استخراج‌شده

یکی از مشکلات رایج هنگام استخراج DNA ژنومی، باقی‌ماندن RNA همراه DNA است.

وجود RNA می‌تواند روی اندازه‌گیری مقدار DNA با روش جذب نوری اثر بگذارد و باعث شود مقدار اندازه‌گیری‌شده بیشتر از مقدار واقعی DNA باشد.

به همین دلیل، اگر خلوص و کمی‌سازی DNA اهمیت زیادی داشته باشد، حذف RNA با RNase treatment می‌تواند بخشی از فرآیند purification باشد.

در چنین شرایطی، استفاده از روش کمی‌سازی مناسب می‌تواند به تعیین دقیق‌تر مقدار DNA کمک کند.

اگر A260/A280 پایین باشد چه کنیم؟

پایین بودن A260/A280 را نباید به‌تنهایی به‌عنوان دلیل قطعی برای رد نمونه در نظر گرفت.

ابتدا باید شرایط اندازه‌گیری بررسی شود:

• آیا Blank مناسب استفاده شده است؟
• آیا محل اندازه‌گیری تمیز بوده است؟
• آیا DNA به‌خوبی حل شده است؟
• آیا احتمال باقی‌ماندن پروتئین وجود دارد؟
• آیا روش استخراج به‌درستی انجام شده است؟
• آیا طیف جذب غیرطبیعی است؟

اگر آلودگی واقعی تأیید شود، بسته به نوع آلودگی و کاربرد نهایی DNA ممکن است purification یا cleanup مجدد لازم باشد.

اگر A260/A230 پایین باشد چه کنیم؟

A260/A230 پایین می‌تواند هشداری برای باقی‌ماندن مواد استخراجی باشد.

در این شرایط بهتر است مراحل:

لیز → جداسازی → شست‌وشو → خالص‌سازی

دوباره بررسی شوند.

در روش‌های ستونی یا روش‌های مبتنی بر مواد شیمیایی، باقی‌ماندن برخی مواد بافر، نمک‌ها، گوانیدین یا ترکیبات آلی می‌تواند روی کیفیت DNA اثر بگذارد.

اگر چنین موادی در نمونه وجود داشته باشند، ممکن است روی PCR، آنزیم‌های محدودکننده یا آماده‌سازی library اثر منفی داشته باشند. Illumina نیز آلودگی‌های باقیمانده و نسبت‌های خلوص نامناسب را از عوامل مؤثر بر موفقیت برخی مراحل library preparation معرفی می‌کند.

اگر DNA Integrity پایین باشد چه کنیم؟

اگر DNA از نظر Integrity دچار مشکل باشد، ابتدا باید مشخص شود تخریب در کدام مرحله اتفاق افتاده است.

برای DNA ژنومی موارد زیر اهمیت دارند:

• از vortex کردن شدید DNA اجتناب شده باشد.
• انتقال نمونه با فشار و دفعات غیرضروری انجام نشده باشد.
• شرایط نگهداری مناسب بوده باشد.
• نمونه چندین بار freeze-thaw نشده باشد.
• مراحل استخراج متناسب با نوع نمونه انجام شده باشد.
• پس از استخراج، DNA در شرایط مناسب نگهداری شده باشد.

در واقع اگر مشکل اصلی شکستگی DNA باشد، افزایش خلوص شیمیایی لزوماً Integrity را برنمی‌گرداند.

کنترل کیفیت DNA برای PCR و Real-Time PCR

برای PCR و Real-Time PCR، مهم‌ترین عوامل شامل مقدار کافی DNA، خلوص مناسب و نبود مواد مهارکننده است.

DNA آلوده به ترکیبات باقی‌مانده از فرآیند استخراج ممکن است عملکرد آنزیم PCR را کاهش دهد.

در برخی کاربردها، حتی DNA با Integrity متوسط نیز می‌تواند برای تکثیر یک ناحیه مشخص قابل استفاده باشد، زیرا PCR فقط به سالم‌بودن ناحیه موردنظر نیاز دارد.

با این حال، اگر DNA شدیداً تخریب شده باشد یا target در قطعات قابل استفاده باقی نمانده باشد، نتیجه آزمایش می‌تواند تحت تأثیر قرار گیرد.

کنترل کیفیت DNA برای NGS

در NGS، کنترل کیفیت DNA اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.

در این کاربرد تنها مقدار DNA کافی نیست و خلوص و Integrity نیز می‌توانند بر مراحل آماده‌سازی library اثر بگذارند.

برای DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا، شاخص‌هایی مانند DIN می‌توانند برای ارزیابی کیفیت ورودی مفید باشند. Agilent نیز DIN را به‌عنوان یک معیار عینی برای ارزیابی کیفیت gDNA در workflowهای NGS معرفی می‌کند.

در نتیجه، معیار پذیرش DNA باید بر اساس نوع library و فناوری sequencing مورد استفاده تعیین شود.

یک نمونه DNA با کیفیت مناسب چه ویژگی‌هایی دارد؟

برای مثال، یک نمونه DNA ممکن است از نظر کنترل کیفیت شرایط زیر را داشته باشد:

• غلظت مناسب برای آزمایش موردنظر
• نسبت A260/A280 مناسب
• نسبت A260/A230 مناسب
• DNA Integrity مطلوب

در چنین شرایطی، نمونه از نظر شاخص‌های اصلی QC وضعیت مناسبی دارد.

اما باز هم تصمیم نهایی باید با توجه به کاربرد انجام شود.

DNA مناسب برای PCR معمولی لزوماً به همان سطحی از Integrity نیاز ندارد که برای برخی کاربردهای NGS یا long-read sequencing موردنیاز است.

چگونه کیفیت DNA را بعد از استخراج ارزیابی کنیم؟

یک روند ساده برای کنترل کیفیت DNA می‌تواند شامل مراحل زیر باشد:

ابتدا غلظت DNA بررسی شود.

سپس خلوص DNA با شاخص‌های A260/A280 و A260/A230 ارزیابی شود.

اگر DNA ژنومی برای کاربرد حساس استفاده می‌شود، Integrity DNA نیز بررسی شود.

در نهایت، نتیجه QC بر اساس نوع آزمایش و کاربرد نهایی DNA تفسیر شود.

این رویکرد باعث می‌شود صرفاً به یک عدد تکیه نکنیم و تصمیم دقیق‌تری درباره استفاده از نمونه بگیریم.

جدول جمع‌بندی کنترل کیفیت DNA

اشتباهات رایج در بررسی کیفیت DNA

غلظت بالا را با DNA باکیفیت اشتباه نکنید

مقدار زیاد DNA الزاماً به معنی خلوص یا Integrity مناسب نیست.

فقط A260/A280 را بررسی نکنید

A260/A280 تنها بخشی از خلوص DNA را نشان می‌دهد و Integrity را ارزیابی نمی‌کند.

A260/A230 را نادیده نگیرید

برخی مواد باقی‌مانده از استخراج ممکن است در این شاخص خود را نشان دهند و بر آزمایش‌های پایین‌دستی اثر بگذارند.

DNA ژنومی را شدیداً vortex نکنید

اگر هدف حفظ DNA با وزن مولکولی بالا باشد، آسیب مکانیکی می‌تواند باعث fragmentation شود.

DNA مناسب برای PCR را با DNA مناسب برای Long-Read Sequencing یکی ندانید

نیازهای QC به کاربرد نهایی وابسته هستند.

خلوص DNA مهم‌تر است یا Integrity؟

هیچ‌کدام را نمی‌توان به‌طور مطلق مهم‌تر دانست.

خلوص DNA مشخص می‌کند آیا مواد ناخواسته همراه DNA باقی مانده‌اند یا خیر.

Integrity DNA مشخص می‌کند DNA تا چه اندازه سالم و یکپارچه باقی مانده است.

برای بعضی PCRها خلوص مناسب ممکن است اهمیت بیشتری داشته باشد؛ برای کاربردهایی مانند whole-genome یا long-read sequencing، یکپارچگی DNA می‌تواند اهمیت بسیار بیشتری پیدا کند.

بنابراین بهترین نمونه، نمونه‌ای است که غلظت، خلوص و Integrity آن با نیاز آزمایش نهایی سازگار باشد.

جمع‌بندی؛ چهار معیار مهم برای کنترل کیفیت DNA

برای ارزیابی کیفیت DNA استخراج‌شده، بهتر است به جای یک عدد یا یک دستگاه، مجموعه‌ای از معیارها را در نظر بگیریم.

غلظت DNA مشخص می‌کند چه مقدار DNA در اختیار داریم.

A260/A280 یکی از شاخص‌های مهم برای بررسی خلوص DNA است.

A260/A230 اطلاعات مکملی درباره احتمال وجود برخی ترکیبات باقی‌مانده از فرآیند استخراج ارائه می‌دهد.

DNA Integrity مشخص می‌کند DNA تا چه اندازه سالم و کم‌تخریب باقی مانده است.

در کاربردهای حساس‌تر می‌توان از ابزارهای تخصصی‌تر مانند TapeStation و شاخص DIN برای ارزیابی یکپارچگی DNA ژنومی استفاده کرد.

در نتیجه:

مقدار DNA مهم است، اما کافی نیست.

خلوص DNA مهم است، اما کافی نیست.

سلامت و یکپارچگی DNA نیز باید متناسب با کاربرد نهایی بررسی شود.

بهترین کنترل کیفیت DNA، ارزیابی چند شاخص در کنار یکدیگر و تفسیر آن‌ها بر اساس آزمایشی است که قرار است با DNA انجام شود.

نحوه محاسبه نتیجه فرایند استخراج DNA به روش كمی:

با استفاده از دستگاه Nanodrop غلظت و کیفیت نمونه DNA بررسی می­شود. 

 محدوده مرجع:

غلظت نمونه DNA به ازای 200µl خون كامل  5 نانوگرم تا 5 میکروگرم  مي باشد که بستگی به نوع نمونه و تعداد سلولها دارد.  260/280: 1.7-2.0 و 260/230: 1.7-2.2 قابل قبول می باشد.

OD260: جذب نوری نمونه مورد آزمایش در طول موج 260 نانومتر است. جذب نوری DNA بطور اختصاصی در این طول موج بررسی می شود.

OD280: جذب نوری نمونه مورد آزمایش در طول موج 280 نانومتر است. جذب نوری پروتئین بطور اختصاصی در این طول موج بررسی می شود.

OD230: جذب نوری نمونه مورد آزمایش در طول موج 230 نانومتر است. جذب نوری RNA ،EDTA ، فنل، گوانیدین تیو سیانات و کربوهیدراتها در این طول موج بررسی می شود.

کنترل کیفیت DNA استخراج‌شده از خون به روش ستونی

پس از استخراج DNA ژنومی از خون به روش ستونی، باید کیفیت نمونه از نظر غلظت، خلوص و یکپارچگی بررسی شود تا مشخص شود DNA برای آزمایش‌های مولکولی موردنظر مناسب است یا خیر. روش ارزیابی و معیار پذیرش نمونه به نوع کیت استخراج و کاربرد نهایی DNA بستگی دارد.

بررسی غلظت و خلوص DNA استخراج‌شده از خون

برای اندازه‌گیری غلظت DNA استخراج‌شده از خون می‌توان از دستگاه‌هایی مانند NanoDrop یا Qubit استفاده کرد. NanoDrop علاوه بر تخمین غلظت، اطلاعاتی درباره نسبت‌های جذب و خلوص نمونه ارائه می‌دهد؛ درحالی‌که Qubit برای اندازه‌گیری اختصاصی‌تر مقدار DNA کاربرد دارد.

در بررسی خلوص، نسبت A260/A280 معمولاً برای ارزیابی احتمال وجود برخی آلودگی‌ها، از جمله پروتئین، استفاده می‌شود. نسبت A260/A230 نیز می‌تواند اطلاعاتی درباره احتمال باقی‌ماندن موادی مانند نمک‌ها، گوانیدین و برخی ترکیبات ناشی از فرآیند استخراج ارائه دهد.

این نسبت‌ها باید در کنار شرایط اندازه‌گیری و دستورالعمل کیت تفسیر شوند؛ زیرا یک مقدار غیرطبیعی لزوماً به معنی وجود یک آلودگی مشخص نیست.

بررسی یکپارچگی DNA استخراج‌شده از خون

برای ارزیابی اولیه سلامت DNA ژنومی می‌توان از الکتروفورز روی ژل آگارز استفاده کرد. DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا معمولاً به‌صورت سیگنالی با اندازه بزرگ در نزدیکی چاهک ژل مشاهده می‌شود. در مقابل، مشاهده smear می‌تواند نشانه‌ای از شکستگی یا تخریب DNA باشد.

البته نتیجه الکتروفورز باید با توجه به نوع نمونه، روش استخراج و کاربرد نهایی تفسیر شود. برای کاربردهای حساس‌تر، روش‌های تخصصی‌تری مانند TapeStation نیز می‌توانند در ارزیابی یکپارچگی DNA کمک‌کننده باشند.

محدوده قابل قبول در کنترل کیفیت DNA استخراج‌شده از خون

مقدار DNA به‌دست‌آمده از خون به عواملی مانند حجم خون اولیه، تعداد سلول‌های هسته‌دار، شرایط نمونه و بازده روش استخراج بستگی دارد. به همین دلیل، نمی‌توان یک بازده ثابت را برای تمام نمونه‌های خون در نظر گرفت.

همچنین نسبت‌های خلوص باید بر اساس دستورالعمل کیت و الزامات آزمایش موردنظر ارزیابی شوند. اگر غلظت یا نسبت‌های جذب خارج از محدوده مورد انتظار باشند، بهتر است ابتدا شرایط اندازه‌گیری، محلول Blank و مراحل استخراج و شست‌وشو بررسی شوند.

در صورت نامناسب بودن کیفیت DNA چه باید کرد؟

اگر نتیجه کنترل کیفیت مطلوب نباشد، بهتر است مراحل استخراج، شست‌وشو، انتقال و نگهداری DNA بررسی شوند. باقی‌ماندن برخی مواد شیمیایی می‌تواند روی خلوص نمونه و عملکرد واکنش‌های پایین‌دستی اثر بگذارد. همچنین برای حفظ DNA ژنومی با وزن مولکولی بالا، باید از هم‌زدن شدید و انتقال‌های غیرضروری نمونه اجتناب کرد.

در نهایت، کیفیت DNA استخراج‌شده از خون باید بر اساس کاربرد موردنظر، مانند PCR، Real-Time PCR یا سایر روش‌های مولکولی ارزیابی شود.

برای آشنایی با روش استخراج DNA ژنومی از خون به روش ستونی، می‌توانید مشخصات کیت استخراج DNA از خون به روش ستونی را بررسی کنید.

سوالات متداول درباره کنترل کیفیت DNA

کنترل کیفیت DNA چیست؟

کنترل کیفیت DNA مجموعه‌ای از بررسی‌ها برای تعیین مقدار، خلوص و یکپارچگی DNA استخراج‌شده و مشخص‌کردن مناسب بودن آن برای آزمایش‌های بعدی است.

چهار معیار اصلی کنترل کیفیت DNA کدام‌اند؟

چهار معیار اصلی شامل غلظت DNA، A260/A280، A260/A230 و DNA Integrity هستند.

آیا غلظت بالای DNA به معنی کیفیت خوب است؟

خیر. غلظت فقط مقدار DNA را نشان می‌دهد و به‌تنهایی نمی‌تواند خلوص یا Integrity DNA را مشخص کند.

A260/A280 در DNA چه چیزی را نشان می‌دهد؟

این نسبت یکی از شاخص‌های رایج برای ارزیابی خلوص DNA و احتمال وجود برخی مواد همراه نمونه است.

A260/A230 در DNA چه چیزی را نشان می‌دهد؟

A260/A230 یک شاخص مکمل برای بررسی خلوص است و می‌تواند احتمال وجود برخی ترکیبات باقی‌مانده از فرآیند استخراج را نشان دهد.

DNA Integrity چیست؟

DNA Integrity به میزان سالم‌بودن و یکپارچگی مولکول‌های DNA و میزان تخریب یا شکستگی آن‌ها اشاره دارد.

DIN چیست؟

DIN یا DNA Integrity Number یک امتیاز عددی برای ارزیابی یکپارچگی DNA ژنومی است که در سیستم‌هایی مانند Agilent TapeStation ارائه می‌شود. مقدار بالاتر معمولاً نشان‌دهنده DNA با Integrity بهتر است.

آیا NanoDrop برای بررسی سلامت DNA کافی است؟

خیر. NanoDrop برای بررسی مقدار و برخی شاخص‌های خلوص مفید است، اما به‌تنهایی میزان شکستگی و Integrity DNA ژنومی را مشخص نمی‌کند.

آیا DNA با Integrity پایین قابل استفاده است؟

بسته به کاربرد ممکن است قابل استفاده باشد. DNA مورد استفاده برای PCR ممکن است نیازهای متفاوتی نسبت به DNA مورد استفاده برای NGS یا long-read sequencing داشته باشد.

NanoDrop بهتر است یا Qubit؟

هر دو کاربرد متفاوتی دارند. NanoDrop علاوه بر مقدار، اطلاعاتی درباره نسبت‌های خلوص ارائه می‌دهد، در حالی که Qubit برای کمی‌سازی اختصاصی‌تر DNA کاربرد دارد.

چرا A260/A230 در DNA پایین است؟

پایین بودن این نسبت می‌تواند با باقی‌ماندن برخی مواد حاصل از استخراج و شست‌وشو، مانند نمک‌ها، گوانیدین یا بعضی ترکیبات آلی مرتبط باشد. در چنین شرایطی روش استخراج و purification باید بررسی شود.

آیا DNA ژنومی سالم باید روی ژل بررسی شود؟

بررسی DNA روی ژل می‌تواند برای ارزیابی کیفی Integrity و مشاهده تخریب مفید باشد، اما برای QC استانداردتر و قابل‌مقایسه‌تر DNA ژنومی می‌توان از سیستم‌هایی مانند TapeStation و معیار DIN استفاده کرد.