بافرهای بیولوژیکی

• بافر چیست و مکانیسم عمل بافر به چه صورت است؟
• بافرهای مورد استفاده باید چه ویژگی هایی داشته باشند؟
• در تنظیم PH بافر چه فاکتورهایی را باید در نظر گرفت؟
• بافرهای رایج مورد استفاده در تحقیقات زیست شناسی چه بافرهایی می باشد؟

در ادامه خواهید خواند….

مفهوم بافر

بسیاری از فرآیندهای بیوشیمیایی به طور قابل توجهی با تغییرات کوچک در غلظت یون های H+ آزاد مختل می شوند.

به همین دلیل معمولاً ، برای تثبیت غلظت H+ در شرایط آزمایشگاهی به محیط بافر مناسب اضافه می شود به گونه ای که بر عملکرد سیستم تحت بررسی تأثیری نگذارد. یک بافر با گرفتن پروتون‌هایی که در طی واکنش‌ها آزاد می‌شوند یا با آزاد کردن پروتون‌هایی که در واکنش‌ها مصرف می‌شوند PH محلول را ثابت نگه می دارند. بافر محلولی  مقاوم در برابر تغییرات pH است که حاوی اسید ضعیف و نمک آن یا باز ضعیف و نمک آن می باشد.

ظرفیت بافر

بافرها از یک اسید و باز مزدوج آن تشکیل شده اند. کیفیت یک بافر با ظرفیت آن، یعنی بر اساس میزان مقاومت بافر در مقابل تغییرات PH هنگامی که اسیدها یا بازهای قوی اضافه می شوند، تعیین می شود.به بیانی دیگر ظرفیت بافر مرتبط با میزان یون های H+ یا  OH- است که می توانند توسط بافر خنثی شوند. ظرفیت بافر  با غلظت بافر مرتبط است.

بافرهای بیولوژیکی

مواد معدنی مختلف در ابتدا به عنوان بافر مورد استفاده قرار گرفتند (مانند فسفات، کاکودیلات، بورات، بی کربنات) و بعدها اسیدهای آلی ضعیف نیز استفاده شد. با این حال، بسیاری از این مواد بی اثر نبوده و  اثرات ماندگاری بر سیستم مورد بررسی دارند (مانند مهار آنزیم ها، برهمکنش با بسترهای آنزیمی و غیره.). اکثر بافرهای بیولوژیکی که امروزه استفاده می شوند توسط NE Good و تیم تحقیقاتی او ساخته شده اند.

(Good et al. 1966, Good & Izawa 1972, Ferguson et al. 1980; “Good buffers”)

به طور کل بافر ها باید طیف وسیعی از معیارها را داشته باشند. اینها شامل پایداری خوب، عدم سمیت،نفوذ پذیری از طریق غشاهای بیولوژیکی،  دقت در pH،  pKa بین 6.0 و 8.0 (منطقه ای که بیشتر واکنش های بیولوژیکی در آن رخ می دهد)، حداقل اثرات نمک به دلیل ترکیب یونی محلول، بدون فعالیت آنزیمی و هیدرولیتیکی و حداقل مشارکت می باشد. در واکنش های بیولوژیکی بافر برای کاربردهای زیست شناسی مولکولی، به عنوان مثال. Tris-Borate-EDTA و Tris-Acetate-EDTA باید عاری از فعالیت DNAse و RNAse باشند.

توصیه هایی برای تنظیم مقدار pH یک بافر

– درجه حرارت

بسته به ماده بافر، pH آن ممکن است با دما تغییر کند. بنابراین توصیه می شود تا حد امکان pH در دمایی که بررسی و تحقیق انجام می شود، تنظیم شود.مقدار pH فیزیولوژیکی برای اکثر سلول های حیوانی در دمای 37 درجه سانتی گراد بین 7.0 و 7.5است

– تیتراسیون

به طور کلی، مقدار pH با استفاده از NaOH/KOH یا HCl تنظیم می شود. اسید یا باز را در حین هم زدن آهسته اضافه کنید تا مانع  افزایش و ایجاد غلظت موضعی یون های H+ یا OH-در بافر بشوید. اگر این کار انجام نشود، مواد بافر ممکن است دستخوش تغییرات شیمیایی شوند که آنها را غیرفعال می کند یا تغییر می دهد به گونه ای که اثر بازدارندگی خواهند داشت.

-قدرت یونی

تنظیم قدرت یونی یک محلول بافر (در صورت لزوم) باید به همان روش تنظیم  مقدار PH هنگام انتخاب الکترولیت صورت بگیرد، زیرا بسته به الکترولیت مورد استفاده افزایش می یابد. نمک‌های تترا متیل آمونیوم یا تترااتیل آمونیوم برای تنظیم قدرت یونی مناسب هستند.

-افزودنی های بافر

چنانچه اجزای دیگری به بافر اضافه شوند مانند( EDTA ، DTT، Mg2+) ، تغییراتی در pH نیز انتظار می رود و دوباره باید اندازه گیری شود.

-کنترل PH متر

امروزه معمولاً pH مترهای دقیق با نمایشگر دیجیتال برای تنظیم مقدار pH یک بافر در دسترس هستند. این PH متر با استفاده از دو استاندارد pH کالیبره می شود که محدوده بافر تنظیم شده را پوشش می دهد. دقت دستگاه را می توان به سادگی با استاندارد کردن pH متر با استفاده از بافر فسفات 50 میلی مولار که سپس 10 برابر رقیق می شود تنظیم کرد.

معیارهای انتخاب بافر

– انتخاب بافر برای محدوده pH صحیح

مقدار pKa بافر باید تا حد امکان در محدوده pH بهینه برای سیستم آزمایش باشد. اگر احتمال افزایش pH در طول آزمایش وجود داشته باشد، باید بافری با مقدار pKa انتخاب شود که کمی بالاتر از مقدار بهینه در ابتدای آزمایش باشد. برعکس، اگر انتظار می رود مقدار pH در طول آزمایش کاهش یابد، یک بافر با مقدار pKa کمی کمتر باید انتخاب شود.

-تعیین pH بهینه یک آنزیم

اگر قرار است یک آنزیم مورد بررسی قرار گیرد، اولین گام معمولاً تعیین شرایطی است که آنزیم بالاترین درجه پایداری و فعالیت ممکن  را نشان می دهد. تعیین pH بهینه به عنوان گام اولیه در این امر مهم است.

توصیه می شود قبل از هر چیز بافرهای شیمیایی مشابه را آزمایش کنید، که به طور کلی طیف گسترده ای از pH را پوشش می دهند، به عنوان مثال. MES، PIPES، HEPES،  TAPS،  CHES و CAPS برای محدوده .pH ~ 5.5 – 11.0

هنگامی که pH بهینه یافت شد، بافرهای مختلف (به عنوان مثال برای مقدار pH 7.5: TES، TEA یا فسفات؛ بلانچارد 1984) را می توان آزمایش کرد تا بتوان اثرات بافر غیر اختصاصی را برای تحقیقات بعدی رد کرد یا به حداقل رساند.

-تعیین غلظت بهینه بافر

ظرفیت بافری مناسب اغلب تنها در غلظت های بالاتر از 25 میلی مولار به دست می آید. با این حال، غلظت بافر بالاتر و قدرت یونی بالا می تواند فعالیت آنزیم را مهار کند. بنابراین غلظت اولیه مناسب بین10 و 25 میلی مولار است.

-انتخاب مواد بافر وابسته به کاربرد

تصمیم در انتخاب یا عدم انتخاب یک بافر نیز به روشی که برای آن استفاده می شود بستگی دارد. علاوه بر اندازه گیری فعالیت، غلظت نیز معمولا زمانی که هدف خالص سازی  پروتئین ها یا آنزیم ها است ، تعیین می شود. درآزمایش برای تشخیص پروتئین، بسیاری از مواد بافر مبتنی بر اسیدهای آمینه می توانند به دلیل ایجاد تداخل در جذب نوری بافر  در محدوده بالای 230 نانومتر منجر به  نتیجه مثبت کاذب شوند.بسیاری از بافرها اساساً برای فیلتراسیون ژل مناسب هستند. بافرهای کاتیونی مانند Tris برای تبادل کروماتوگرافی آنیون ترجیح داده می شوند .مواد بافر نباید جذب قابل توجهی در محدوده 240 تا 700 نانومتر داشته باشند.

بافرهای رایج مورد استفاده در تحقیقات زیست شناسی:

Krebs-Henseleit bicarbonate buffer, pH 7.4

 ,1.2mM KH2PO4, 1.2mM MgSO4 , 2.5mM CaCl2 , 4.7mM KCl, 119mM NaCl

 PH 7.4 (at 37°C) when equilibrated with 95% O2 and 5% CO2. Adjust the pH before use.

Hank’s Biocarbonate Buffer, pH 7.4

 137mM NaCl

 5.4mM KCl

 0.25mM Na2HPO4

 0.44mM KH2PO4

 1.3mM CaCl2

 1.0mM MgSO4

 4.2mM NaHCO3

pH 7.4 (at 37°C) when equilibrated with 95% O2 and 5% CO2. Adjust the pH before use.

Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4

 150mM NaCl

 10mM Potassium Phosphate buffer

(1 liter PBS can be prepared by dissolving 8.7 g NaCl,1.82 g K2HPO4 • 3H2O, and 0.23 g KH2PO4 in 1 liter of distilled water.Adjust the pH before use).

PBS به اشکال مختلفی می تواند آماده سازی شود:

 137mM NaCl

 2.7mM KCl

 10mM Na2HPO4

1.76mM KH2PO4

Tris Buffred Saline (TBS), pH 7.4

 10mM Tris

 150mM NaCl

(1 liter of TBS can be prepared by dissolving 1.21 g of Tris base and 8.7 g of NaCl in 1 liter of distilled water. Adjust the pH before use.)

TBST (Tris Buffered saline and TWEEN®-20)

 10mM Tris-HCl, pH 8.0

 150mM NaCl

0.1% TWEEN®-20

Stripping Buffer for Western Blotting Applications

 62.5mM Tris buffer, pH 6.7 to 6.8

2% Sodium dodecyl sulfate (SDS)

 100mM β-Mercaptoethanol

Cell Lysis Buffer

 20mM Tris-HCl (pH 7.5)

 150mM NaCl

 1mM Sodium EDTA

 1mM EGTA

1% TRITON® X-100

 2.5mM Sodium pyrophosphate

 1mM β-Glycerophosphate

 1mM Sodium orthovanadate

1 µg/ml Leupeptin

بافر تریس

تریس (تریس-(هیدروکسی متیل)-آمینومتان) از پرمصرف ترین ماده  بافری در آزمایش های بیولوژیکی است. دلایل این امر این است که تریس نسبتاً ارزان است و به راحتی در آب قابل حل بوده ودر بسیاری از سیستم های آنزیمی بی اثر است (بدون اثر متقابل با اجزای دیگر) و دارای ظرفیت بافری بالایی است.

با این حال، تریس دارای یک سری ویژگی های منفی از جمله سمی بودن برای بسیاری از سلول های پستانداران ، وابسته بودن مقدار pH محلول تریس به غلظت است که می تواند در رقت، مقدار pH کاهش یابد و یا درجه  بالایی از حساسیت به دما ، می باشد .

بافر TE

این بافر به بافر استاندارد برای ذخیره سازی اسیدهای نوکلئیک تبدیل شده است. در مقادیر مختلف pH استفاده می شود. به طور کلی تهیه شده با مخلوط کردن محلول های بافر تریس (1 M) با محلول استوک EDTA (0.5 M؛ pH 8.0) حاصل می شود. بافر آماده شده می تواند همچنین پس از اتوکلاو در دمای اتاق نگهداری شود. محلول های استوک TE در غلظت های 100X تا 1X تهیه می شوند.

بافرهای فرار

تعدادی بافر در دسترس هستند که می توانند به راحتی و به طور کامل  از واکنش حذف شوند. این بافرها به خصوص  زمانی استفاده می شوند که واکنش های بعدی نباید حاوی هیچ کدام از آنها باشند. آنها برای الکتروفورز، کروماتوگرافی تبادل یونی یا برای هضم پروتئین ها به دنبال حذف پپتیدها و اسیدهای آمینه مفید هستند. این مواد بافری عبارتند از: اسید فرمیک، آمونیاک، کربنات آمونیوم، اسید استیک، پیریدین و تری اتانول آمین. محدوده pH 1.9 – 8.9 را می توان با مخلوط مناسب این مواد پوشش داد.

بافر برای الکتروفورز ژل

الکتروفورز ژل به یکی از مهمترین روشها در آنالیز اسیدهای نوکلئیک و پروتئین تبدیل شده است. سه بافر اصلی به عنوان استانداردی برای تکنیک های الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید و الکتروفورز ژل آگارز معرفی و مورد استفاده قرار می گیرند: بافر TAE (Tris-acetate-EDTA)، بافر TBE (Tris-borate-EDTA) و بافر Tris-glycine.

بسته به کاربرد، ممکن است مواد دیگری مانند اوره و SDS به آنها اضافه شود. از آنجایی که روش های  زیادی مبتنی بر این تکنیک‌های الکتروفورز وجود دارد، تعداد بافرهای تغییریافته به نسبت بالایی وجود دارد.