مبانی PCR و کاربرد آن

مبانی PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز که به اختصارPCR   مخفف  Polymerase Chain Reaction  خوانده میشود ، یک روش متداول آزمایشگاهی است که  اصول کار آن ، تکثیر قطعه مشخصی از DNA است. در این روش ، با هیچ محدودیتی در انتخاب قطعه هدف  مواجه نیستیم و می تواند شامل کل  یا قسمتی از ژن‌های رمزکننده پروتئین ‌، RNA یا قسمتی از یک زیست نشانگر باشد که جهت احراز هویت در پزشکی قانونی اهمیت دارد.

بنابراین،‌ هدف از PCR ایجاد تعداد کپی‌های فراوان از ناحیه ی هدف است. در مرحله ی بعدی ،این کپی‌ها جهت مطالعه ، بررسی ، تجزیه و تحلیل خصوصیات و یا مراحل مختلف کلونینگ و دیگر موارد مانند تعیین توالی ، انتقال به ژل الکتروفورز و درج در پلاسمید مورد استفاده قرار می گیرد .

به همین علت تکنیک PCR در وجوه مختلف علمی مانند زیست شناسی مولکولی ، تشخیص پزشکی و نیز در گروه هایی از اکولوژی  کاربرد بسیاری دارد .

اجزای اصلی تست  PCR

از اجزای اصلی یک واکنش PCR  می توان به موارد زیر اشاره کرد :

آنزیم Taq پلیمراز

پرایمرها

DNA  الگو

نوکلئوتیدها ( dNTP)

بافر

این موارد همگی در یک تیوب کوچک، جمع شده  و در مرحله ی بعدی ، یک چرخه ی پی در پی از گرمایشی و سرمایشی مکرر، منجر به بوجود آمدن میلیون ها کپی از DNA  هدف می شود .

آنزیم Taq  پلیمراز

اساس کار واکنش  PCR نیز مانند پروسه ی همانندسازی DNA ، بر مبنای  آنزیم DNA پلیمراز است . آنزیم Taq  پلیمراز، رشته جدید DNA  را از روی DNA الگو کاتالیز می کند . این آنزیم از باکتری  ترموس آکواتیکوس که مقاوم به گرما است ، گرفته می شود . محل  زندگی این باکتری ها در چشمه‌های آب داغ  و دریچه‌های گرمابی است. از آنجا که این دریچه‌های گرمایی در عمق دریا و اقیانوس و در نزدیکی جایگاه ‌های فعال آتشفشانی قرار داشته و نیز محل خروج هوای گرم هستند، از این رو آنزیم‌های این باکتری، از جمله DNA پلیمراز، نسبت به گرما پایداری بالایی دارند. به گونه ای که فعال ترین حالت این آنزیم در دمای 70 درجه سانتیگراد است . باید توجه داشته باشید که در این دما بیشتر آنزیم‌های انسانی، غیرفعال می شوند.

در زیر به توضیح سه عبارت علمی در زمینه ی آنزیم ها می پردازیم :

• پایداری گرمایی و یا به عبارتیHeat-Stability به مقاومت آنزیم در نگهداری ساختار سه‌بعدی و عملکرد خود در دماهای بالاتر از محیط گفته می شود .
• قدرت پردازش یا Processivity به مقاومت آنزیم در حفظ اتصال به سوبسترا تا انتهای واکنش گفته می شود .
• صحت عملکرد یا Fidelity  به توانایی اتصال مولکول صحیح، در جای مناسب گفته می شود. در مورد پلیمرازها، این خصوصیت، منجر به قرارگیری مولکول مکمل در مقابل هر نوکلئوتید می شود.

یکی از عواملی که آنزیم Taq  پلیمراز را برای انجام واکنش PCR  مناسب و ایده آل می سازد، مقاومت گرمایی این آنزیم است ، چون در طی واکنش PCR  دما بطور متناوب افزایش می یابد تا رشته های DNA الگو از هم باز شده و دوباره تکثیر آغاز شود. فعالیت آنزیم Taq  پلیمراز در دمای 70 درجه سانتی گراد به طور ویژه ای  افزایش می یابد  و در دمای حدود 90 درجه سانتیگراد یا بالاتر ، بدون تغییر در فعالیت آنزیم ، ساختار آن حفظ می‌ شود و با پایین آمدن دما، دوباره به حالت فعال خود بازمی‌گردد.

در زیر فعالیت این آنزیم را در دماهای مختلف می توانید بررسی کنید:

از دیگر عوامل مهم در مورد آنزیم  Taq DNA polymerase ، توانایی پردازش بالای آن است ، به طوری که قادر هستند قطعاتی به طول سه هزار نوکلئوتید را پردازش کنند  و حتی میتوان با ایجاد کمی تغییر در شرایط ، این عدد را تا چهار هزار نوکلئوتید هم افزایش داد و این توانایی را بهینه کرد. از دیگر خصوصیات بارز آنزیم  Taq DNA polymerase  ، صحت عملکرد و توانایی  proofreading یا ویرایش خطا است  که در Taq پلیمرازهای رایج به ازای هر سه هزار باز ، یک نوکلئوتید غلط است .

پرایمر های PCR

آنزیم Taq پلیمراز فقط در حضور پرایمر توانایی سنتز رشته جدید را دارد . در واقع پرایمرها، اولیگونوکلئوتیدهایی از جنس DNA هستند که سر OH آزاد را در اختیار آنزیم قرار می دهند و یک نقطه آغاز را در برای آن تعیین می کنند. به عبارت دیگراین نقطه شروع ، همان گروه هیدروکسیل آزاد موجود در انتهای 3′آخرین نوکلئوتید مولکول پرایمر می باشد. پرایمرهای لازم در واکنش زنجیره‌ ای پلیمراز ( PCR   ) قطعه‌های کوتاهی از یک DNA تک رشته‌ای هستند که عموما طولی در حدود 20 نوکلئوتید دارند. طراحی این قطعات به گونه ای است که ناحیه هدف را در بر بگیرند. بنا براین در هر واکنش  PCR ، دو پرایمر جهت اتصال به هر یک از دو رشته ی DNA لازم است  و این اتصال به وسیله پیوند هیدروژنی بین پرایمر و DNA الگو  انجام می گیرد . پرایمر متصل به این رشته forward primer   و پرایمر متصل به رشته مکمل  reverse primer  نام دارند .

بافر  PCR

فعالیت هر آنزیمی در یک شرایط  ویژه ای  در بالاترین حد خود است . در واقع ، بافرها کمک می کنند که این شرایط خاص تشکیل و تا انتهای واکنش حفظ شود .بافر آنزیم Taq پلیمراز که معمولا در غلظت 10X است ، شامل Tris HCl ،‌   KClو معمولا MgCl2 می باشد.  Tris HCl  به پایداری  pH بین 8 تا 9.5 کمک می‌کند.  در واقع دو عامل در این بافر نقش مهمی دارند :  اولی وجود یون پتاسیم که منجر به استحکام  فرایند اتصال پرایمرها به الگو،‌ هنگام آنیلینگ می‌شود و دیگری وجود یون منیزیم  که همچون کوفاکتور آنزیم پلیمراز، به آن متصل خواهد شد تا آن را به بالاترین فعالیت ساختاری خود برساند.

مراحل  PCR

مراحل اصلی واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) به ترتیب زیر میباشد :

Denaturation

Annealing

Extension

فرایند دناتوراسیون یا واسرشتن در دمای 96 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد و در طول آن،‌ این افزایش دمای محیط، سبب باز شدن دو رشته الگو از یکدیگر میگردد. سپس مولکول‌های تک رشته‌ای بوجود آمده ،‌ در مرحله ی بعدی ، به عنوان الگو استفاده می شوند.

سپس وارد مرحله ی اتصال می شویم که در دمای بین 55 تا 65 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد و در طول آن، با کاهش دمای محیط، اسباب اتصال پرایمرها به توالی‌های مکمل خود مقدور میگردد. پرایمرها‌ در جهت 5′→3′ خود  و 3′→5′ رشته الگو به آن متصل می‌شوند. بدینگونه،‌ سر 3’آن‌ها که شامل گروه هیدروکسیل آزاد است،‌ در تصرف آنزیم پلیمراز ، همانندسازی DNA را در ناحیه هدف ، شروع کند.

در قسمت گسترش یا طویل‌سازی که در دمای 72 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد ، با افزایش تقریبی دمای محیط، شرایط مناسب برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز و ساخت رشته جدید، ایجاد می شود.

این مراحل و چرخه دمایی در PCR ، اغلب بین 20 تا 25  بار تکرار می‌شود.

انواع PCR

با ایجاد کمی تغییر در اجزا یا وضعیت دمایی PCR، می‌توانیم  این واکنش را برای اهداف متفاوتی ایده آل کنیم که در زیر به چند مورد آن اشاره میکنیم :

• qPCR یا ریل تایم پی سی آر RT-PCR
• Multiple PCR
• Nested PCR
• High Fidelity PCR
• Fast PCR
• Hot Start PCR
• GC-Rich PCR
• Long-range PCR
• Arbitrary Primed PCR

الکتروفورز محصولات PCR

برای مشاهده نمونه‌ها روی ژل، هنگام قرار دادن آن‌ها درون چاهک،از رنگ‌های قابل مشاهده با نور UV مانند رنگ سیف استین DNA safe stain  استفاده میشود.البته در گذشته، از اتیدیوم بروماید برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شد، اما به دلیل سمی و جهش‌زا بودن آن ها، کار با آن‌ها در آزمایشگاه ها ممنوع اعلام شد. پس از پایان حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل توسط دستگاهی به نام ژل داک تصویربرداری میشود.

با این تکنیک کاربر قادر به شناسایی مولکولهای DNA با طول های متفاوت است. از آنجاییکه مولکول‌های DNA دارای بار منفی هستند زمانی که روی ژل  و تحت جریان الکتریی قرار میگیرند به سمت الکترود مثبت حرکت می‌کنند. در این شرایط ، جداسازی مولوکول های DNA ، تنها بر اساس اندازه و سایز آنها انجام می‌شود. حرکت رشته‌های کوتاه DNA سرعت بیشتری نسبت به مولکول‌های بلندتر دارند، بنابراین جداسازی  مولکول‌های DNA با اندازه‌های متفاوت آسان تر انجام میشود.همانطور که قبلا هم اشاره کردیم ردیابی نمونه ها، با اضافه کردن رنگهای فلورسنت درون چاهک ژل  انجام میگیرد. بعضی از کاربران، رنگ‌های فلورسنت را با ژل ، درست قبل از انتقال آن به قالب الکتروفورز مخلوط میکنند که در این شرایط ، نیاز به اضافه کردن رنگ هنگام لود نمونه  نیست. الکتروفورز برای مولکول‌های‌ DNA به صورت افقی انجام می‌گیرد که روشی ساده‌تر نسبت به روش عمودی است.

بعد از توقف جریان، باند مولکول‌های DNA در اندازه‌های مختلف بر روی ژل نمایان است که جهت تعیین اندازه باند نمونه، از یک نشانگر و یا در اصطلاح  (Ladder) به عنوان استاندارد استفاده می‌شود. Ladder ( لدر ) روی ژل به صورت باندهایی با طول معین نمایان بوده و با استفاده از آن اندازه باندهای نمونه بر روی ژل را می توان ارزیابی کرد.

کاربردهای PCR

از متداول ترین کاربردهای  واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) میتوان به موارد زیر اشاره کرد:

• بررسی و مطالعه ی ژن‌های موثر در یک بیماری
• بررسی و مطالعه ی فاکتورهای بیماری عفونی
• تشخیص پزشکی مناسب
• تکثیر یک قطعه از رونوشت ژن یا Reverse Transcriptase PCR
• جهت احراز هویت
• بررسی دقیق تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن یا Real-Time PCR
• بررسی تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن در مقایسه با ژن دیگر یا Semi-quantitative PCR

در شکل بالا کاربرد PCR در شناسایی بیماری عفونی کووید19 را می بینید.