تکنیک PCR در بیولوژی مولکولی

تکنیک پی سی آر/ PCR  یکی از جدیدترین تکنیک ها در بیولوژی مولکولی می باشد. از نظر اصول عملی، PCR  به همانند سازی DNA  در سلول ها تشابه دارد و از فرایند طبیعی که در سلول ها رخ می دهد الهام گرفته شده است. در این روش، از روی یک DNA  الگو، به کمک آنزیم DNA  پلی مراز همانندسازی صورت می گیرد و رشته ی جدید DNA ، بین دو جایگاه اتصال پرایمر، در طی هر چرخه PCR  تکثیر پیدا می کند.

جهت خرید و قیمت مستر میکس pcr پی سی آر 

خرید و قیمت مستر میکس سوپر pcr پی سی آر 

مسترمیکس PCR

PCR Master Mix گاهی اوقات با عنوان Super Mix  یا ready Mix  شناخته می شود. PCR Master Mix شامل معرف های مورد نیاز برای انجام واکنش PCR  در غلظت های بهینه سازی شده می باشد.

مستر میکس معمولا شامل یک آنزیم DNA  پلی مراز مقاوم در برابر حرارت، MgCl2، dNTP و بافر مناسب  PCR (غالبا با مواد افزودنی اختصاصی/  تقویت کننده)  می باشد. استفاده از مستر میکس پی سی آر ریسک آلودگی و خطاهای احتمالی حجم برداری( pipetting ) را کاهش می دهد و باعث صرف جویی در زمان و جلوگیری از خطاهای احتمالی در ساختن مستر میکس می شود، همچنین استفاده از مستر میکس بر همگنی معرف ها تاثیر مثبتی ایجاد می کند. از مزایای استفاده از مستر میکس این است که محققان بدون نیاز به محاسبه و اضافه کردن مقادیر دقیق آنزیم ها، بافر ها، کوفاکتورها ( معمولا  MgCl2 )، آب و dNTP ، تست های مختلفی با غلظت های متفاوت از نمونه های DNA  و RNA  را تنظیم (setup) می کنند.

مسترمیکس PCR آماده مصرف

در مستر میکس آماده، تمام یا بیشتر معرف های مورد نیاز برای انجام واکنش PCR ، یکبار تهیه شده است و جهت انجام تست، محقق نیاز به آماده سازی مجدد این معرف ها ندارد و فقط کافی است که مقدار مورد نیاز از پرایمرها و پروب ( در صورت نیاز ) و نمونه های DNA  ژنومیک ، پلاسمید و یا cDNA  و آب (nuclease free water) را به مستر میکس اضافه کند. ممکن است یک یا چند رنگ برای تشخیص فلورسنت از محصول نهایی در qPCR (Real Time quantitative PCR) گنجانده شود.

مستر میکس مورد نیاز برای واکنش Real Time PCR شامل یک ترکیب فلورسنت ( معمولا سایبرگرین ) نیز می باشد. تفاوت در انتخاب مستر میکس، گاهی اوقات می تواند تفاوت در نتایج آزمایشات را توضیح دهد؛ برای مثال می توان به اندازه گیری طول تلومر اشاره کرد.

کاربرد های مستر میکس پی سی آر/ PCR Master Mix :

به طور کلی برای انجام یک روند PCR با توان عملیاتی بالا  (High-throughput PCR ) و همچنین برای انجام PCR  روتین، معمولا از مستر میکس ها استفاده می شود. از مزایای استفاده از مستر میکس همراه با آنزیم DNA  پلی مراز هات استارت (Hot start DNA polymerase )، می توان به  انجام واکنش Multiplex PCR و همچنین کاهش دایمر پرایمر ها در واکنش PCR  اشاره کرد.ممکن است آزمایشگاه ها، نمونه DNA  یا RNA  را تغیر دهند در حالیکه  با اطمینان می توانند به معرف های درون مستر میکس آماده اعتماد کنند و جهت  صرفه جویی در زمان و هزینه از آن استفاده نمایند.

محتویات مستر میکس پی سی آر/ PCR Master Mix به صورت زیر می باشد:

• آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت ( معمولا از آنزیم Taq  استفاده می شود)
• بافر
• کوفاکتور ( یکی از رایج ترین کوفاکتورهای مورد استفاده در واکنش PCR، کلرید منیزیم MgCl2 می باشد.)
• dNTP
• پرایمرها
• آب (nuclease-free water or PCR-grade water )
• Template

نمونه DNA  الگو برای واکنش PCR  می تواند ژنومی، پلاسمید و یا cDNA  باشد. کیفیت DNA  الگو برای انجام PCR  بسیار حائز اهمیت است.هر چه DNA  الگوی استفاده شده در واکنش PCR  خالص تر باشد، دریافت نتایج  خوب آسان تر صورت می گیرد. مقدار ایده آل DNA  الگو  بستگی به منبع شما دارد اما برای نمونه DNA  پلاسمید، معمولا بین 1pg-1ng و حدود1ng-1 µg  از نمونهDNA  ژنومیک، برای هر PCR  مورد نیاز است.

بسیاری از مراکز تحقیقاتی، از مستر میکس های پیش ساخته شده، به منظور صرفه جویی در زمان و جلوگیری از خطاهای احتمالی در اندازه گیری استفاده می کنند. بیشتر مستر میکس های تجاری به نوع PCR   و یا PCR  ای که با دستگاه ترموسایکلر خاصی سازگار است، متکی می باشند و پیشرفت واکنش بر اساس میزان رنگ فلورسنس موجود در مستر میکس سنجیده می شود.

با توجه به نیاز کاربران در مصارف گوناگون مسترمیکس های آماده، یکتا تجهیز آزما اقدام به ارائه دو محصول با شرایط زیر کرده است :

مستر میکس  پی سی آر |  PCR MasterMix 2X ، که یک محصول آماده شده برای واکنش PCR است که حاوی تمام معرف های مورد نیاز برای پی سی آر به جز پرایمرها و Template  می باشد. مستر میکس پی سی آر/  PCR MasterMix 2X شرکت یکتا تجهیز آزما، حاوی آنزیم  DNA پلی مراز Taq با کیفیت بالا و بافری که در یک غلظت 2x  بهینه سازی شده است.

مستر میکس سوپر پی سی آر | Super PCR mastermix که علاوه بر آنزیم DNA پلی مراز  Taq دارای آنزیم دیگری با قابلیت (proofreading)   3’ → 5’ exonuclease می باشد که حاوی تمام معرف های مورد نیاز به جز پرایمرها و نمونه است.

بهینه سازی مسترمیکس PCR

طبق آخرین نسخه ی بهینه سازی شده مستر میکس یکتا تجهیز آزما در بخش تحقیق و توسعه و انجام آزمایشات لازم در دپارتمان کنترل کیفی این مجموعه ، عملکرد مسترمیکس PCR با امکان تکثیر DNA با غلظت و کیفیت مختلف  فراهم شده است.

بعبارتی می توانید در غلظت های بسیار پایین از نمونه الگو (همانند 1ng)، محصول  PCR از الگو هدف را داشته باشید.  در نتیجه میزان بازدهی واکنش پی سی آر  افزایش خواهد یافت. این بهینه سازی پس از بررسی های صورت گرفته  (شکل رو به رو )