فرآیند PCR
برای انجام یک واکنش PCR به ترکیبات بافر، dNTP، آنزیم DNA پلیمراز، پرایمرها و DNA Templet نیازمندیم و این واکنش توسط دستگاه ترموسایکلر انجام می شود. آنزیم DNA پلیمراز، با انتخاب نوکلئوتید صحیح ، نوکلئوتید را طی ساخت زنجیره DNA به پرایمر اضافه می کند تا زنجیره DNA ساخته و طویل شود. به طور کلی، دو دسته از آنزیم های DNA پلیمراز، شامل DNA پلیمرازهای وابسته به DNA و DNA پلیمرازهای وابسته به RNA یا آنزیم ترانس کریتپازهای معکوس (ریورس ترنس کریپتاز) در فرایند PCR، بر اساس الگوی درنظر گرفته شده مورد استفاده قرار می گیرند.
آنزیم Taq DNA polymerase
آنزيم Taq پلیمراز ، ابتـدا از نوعی مایکوباکتریوم گرما دوست به نام باكتري Thermus aquaticus كه در چشمه هـاي آب گـرم زندگي می کنند اسـتخراج شـده است، این آنزیم به گرما مقاوم است و به منظور تكثير قطعات خاصی از DNA و واكـنش زنجيرهاي پليمراز (PCR) استفاده مي گردد. علت نام گذاری آنزیم Taq استفاده از جنس و گونه ی باکتری (Thermus aquaticus=Taq) باشد.
این ویژگی پایدار بودن آنزیم به دماهای بالا، این امکان را فراهم می کند که فقط با یک بار اضافه کردن آنزیم در ابتدای واکنش PCR، چرخه های تکثیر DNA به طور مکرر انجام می شود.
آنزيم DNA پلیمراز Taq از اولین آنزیم هایی می باشد که قادر است دمای بالای مرحله ی denaturation را در واکنش PCR تحمل کند. در دمای 95 درجه سانتی گراد، نیمه عمر این آنزیم 40 دقیقه است.
نقاط ضعف آنزیم Taq DNA polymerase
یکی از نقاط ضعف آنزیم Taq این است که این آنزیم فاقد فعالیت تصحیح اگزونوکلئازی ( exonuclease proofreading ) در جهت 3′ به 5′ می باشد و این امر باعث می شود که دقت کار آنزیم پایین بیاید و خطاهای ایجاد شده توسط این آنزیم تصحیح نمی شود. احتمال خطای این آنزیم در حدود یک در ده هزار نوکلئوتید اندازه گیری شذه است.
امروزه گزینه های دیگری علاوه بر آنزيم DNA پلیمراز Taq برای واکنش PCR وجود دارد. نوع آنزیم پلیمراز استفاده شده در واکنش PCR تاثیر قابل توجهی در فرایند PCR دارد مثلا بر درجه خلوص و مقدار محصول و همچنین میزان صحیح بودن همانندسازی محصول رونویسی شده، نقش مهمی دارد.
آنزیم Pfu DNA polymerase
آنزيم Pfu DNA polymerase، آنزیم دیگری از مجموعه آنزیم های DNA های پلیمراز مورد استفاده در PCR می باشد در دمای بالا، مقاوم تر از آنزیم Taq است و همچنین دارای قابلیت تصحیح کنندگی می باشد. این قابلیت باعث پایین آمدن احتمال خطای نوکلئوتیدی می شود.عموما در مواردی که تکثیر DNA جهت تعیین توالی صورت می گیرد، از آنزیمPfu استفاده می شود.
نقاط قوت آنزیم Pfu DNA polymerase
آنزیم Pfu | آنزیم Pfu DNA polymerase از باکتری Pyrococcus furiosus استخراج شده است و متعلق به خانواده B ازآنزیم های DNA polymerase می باشد. آنزیم Pfu دارای فعالیت تصحیح کنندگی اگزونوکلئازی ( exonuclease proofreading ) در جهت ‘5 → ‘3 می باشد، به این صورت که در هنگام ساخت DNA از انتهای ‘3 → ‘5 در صورت بروز اشتباه، آنزیم Pfu با فعالیت اگزونوکلئازی خود در جهت ‘5 → ‘3 ، بلافاصله نوکلئوتیدی که به اشتباه چسبیده است را در انتهای ‘3 رشته DNA جدید حذف می کند. این ویژگی باعث می شود که قطعات DNA تولید شده طی واکنش PCR توسط آنزیم Pfu | آنزیم Pfu DNA polymerase ضریب خطای کمتری نسبت به قطعات DNA تولید شده توسط آنزيم DNA پلیمراز Taq داشته باشند.
آنزیم Pfu موجود در بازار معمولاً منجر به میزان خطا ی 1 در 1.3 میلیون جفت باز می شود و هنگام amplify کردن قطعات با اندازه 1kb ، می تواند منجر به ایجاد % 2.6 جهش در محصولات می شود . Pfu کندتر است و معمولاً 1 تا 2 دقیقه زمان در هر چرخه، برای amplify کردن 1kb DNA در 72 درجه سانتی گراد نیاز دارد که این زمان در آنزیم Fast Pfu DNA Polymerase شرکت یکتا تجهیز آزما به 15 ثانیه کاهش یافته و منجر به سرعت و عملکرد بهتر آنزیم Pfu شده است. در تصویر ژل رو به رو ، نمونه ای از عملکرد آنزیم Fast Pfu DNA Polymerase شرکت یکتا تجهیز آزما مشاهده می شود .
بنابراین در تکنیک هایی که نیاز به صحت و دقت ( high-fidelity ) بیشتری هست و میزان خطا در کمترین حد ممکن باید باشد مانند انگشت نگاری DNA، استفاده از آنزیم Pfu | آنزیم Pfu DNA polymerase نسبت به آنزيم Taq DNA پلیمراز برتری دارد.
برای تکنیک هایی که علاوه بر صحت به سرعت بالا نیاز دارند، بهترین حالت، استفاده ترکیبی از هر دو این آنزیم ها می باشد که، ترکیب صحت بالای آنزیم Pfu و سرعت فعالیت پلیمرازی آنزیم Taq این مهم را فراهم می سازد.
عملکرد آنزیم DNA پلیمراز در واکنش زنجیره ای پلی مراز(PCR) چیست؟
آنزیم DNA پلیمراز، با انتخاب نوکلئوتید صحیح ، نوکلئوتید را طی ساخت زنجیره DNA به پرایمر اضافه می کند تا زنجیره DNA ساخته و طویل شود.
ویژگی آنزيم Taq پلیمراز چیست؟
آنزيم DNA پلیمراز Taq از اولین آنزیم هایی می باشد که قادر است دمای بالای مرحله ی denaturation را در واکنش PCR تحمل کند. در دمای 95 درجه سانتی گراد، نیمه عمر این آنزیم 40 دقیقه است. این ویژگی پایدار بودن آنزیم به دماهای بالا، این امکان را فراهم می کند که فقط با یک بار اضافه کردن آنزیم در ابتدای واکنش PCR، چرخه های تکثیر DNA به طور مکرر انجام می شود.
ویژگی آنزيم Pfu DNA polymerase چیست؟
آنزيم Pfu DNA polymerase، آنزیم دیگری از مجموعه آنزیم های DNA های پلیمراز مورد استفاده در PCR می باشد در دمای بالا، مقاوم تر از آنزیم Taq است و همچنین دارای قابلیت تصحیح کنندگی می باشد. این قابلیت باعث پایین آمدن احتمال خطای نوکلئوتیدی می شود.
- در مواردی که تکثیر DNA جهت تعیین توالی صورت می گیرد پیشنهاد می شود از چه انزیمی جهت تکثیراستفاده شود؟
عموما پیشنهاد می شود جهت تکثیر به منظور تعیین توالی از آنزیمPfu استفاده شود.
