CRISPR | فناوری کریسپر

فناوری کریسپر (CRISPR) برای اصلاح ژن:

CRISPR مجموعه‌ای از توالی‌های DNA است که در ژنوم پروکاریوت‌هایی مانند آرکیا و باکتری‌ها یافت می‌شود. توالی‌های CRISPR با مجموعه ای از تکرارهای مشابه که با بخش‌های غیر مشابه که spacer نامیده می شوند از هم جدا شده اند.این توالی‌های DNA در ایمنی تطبیقی ​​در برابر عناصر ژنتیکی مهاجم، از جمله ویروس‌ها و پلاسمیدها نقش دارند.

ژنوم برخی از پروکاریوتها شامل توالی های تکرار شونده  کوتاه، palindromic هستند که بارها تکرار شده و توسط spacer های منحصر به فرد و متفاوتی از هم جدا می شوند.

تکرارها بخش هایی از DNA هستند که همگی توالی یکسانی دارند. آنها معمولاً  طولی حدود 30 جفت باز دارند.  این تکرارها palindromic نامیده می شوند زیرا معمولاً شامل یک ردیفی از بازها هستند که  یک رشته ی مکمل با توالی مشابه دارند. شکل زیر ساختار CRISPR را نشان می دهد.

ساختار کریسپر

در اغلب موارد در کنار این بخش های تکرار- فاصله ژن هایی هستند که پروتئین CAS را کد می کنند.  CAS تمام فعالیت های مورد نیاز برای  ایجاد ایمنی را انجام می دهند. شکل زیر فعال کردن سیستم ایمنی توسط  سیستم CRISPR-CAS در پروکاریوت ها را نشان می دهد.

فعال کردن سیستم ایمنی توسط سیستم crspr cas

کشف ( Clusteredly Regully Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR و پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas)- کاربردهای تحقیقات ژنتیکی را در هزاران آزمایشگاه در سراسر جهان گسترش داده است و منجر به تغییر نگرش ما به ژن درمانی می شود. ژن درمانی رایج و قدیمی نگرانی هایی به همراه داشته است، زیرا درمان سنتی بر اساس انتقال یک ناقل ویروسی حامل  ژن های درمانی می باشد که می تواند هم باعث اضافه شدن یک انکوژن بشود و هم سمیت ایمونوژنیک ایجاد کند. در حالی که ناقل‌های ویروسی یک وسیله انتقال کلیدی باقی می‌مانند، فناوری CRISPR یک جایگزین نسبتا ساده و کارآمد برای ویرایش ژن‌ در جایگاههای خاصی فراهم می‌کند و برخی نگرانی‌های ایجاد شده توسط ژن درمانی رایج را از بین می‌برد.

ویرایش ژن CRISPR

DNA راهنمای زندگی روی زمین است. DNA ویژگی های اساسی یک موجود زنده را رمزگذاری می کند – نحوه زندگی، رشد و تولید مثل. تغییر توالی DNA در یک سلول زنده به عنوان ویرایش ژنوم یا ویرایش ژن شناخته می شود.

ژنوم CRISPR

کشف ویرایش ژنوم CRISPR، فرآیند ویرایش ژن را که برای سالهای طولانی یک فرآیند چالش برانگیز بود ، بسیار آسان کرده است. در سال 2012، تحقیقاتی توسط جنیفر دودنا، بنیانگذار IGI، امانوئل شارپنتیه و تیم‌هایشان، روشی برای تغییر کاربری سیستم ایمنی باکتریایی به نام CRISPR – مخفف عبارت Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – برای ایجاد شکاف در DNA در مکان‌های دقیق با استفاده از یک آنزیم مرتبط با CRISPR (پروتئین Cas9) مانند قیچی مولکولی برای برش DNA یافتند. اکنون دانشمندان می توانند قطعات جدیدی از DNA  را به ژنوم موجودات زنده در سلول اضافه کنند که به عنوان الگو در هنگام ترمیم شکستگی در DNA به کار برده شوند. به این ترتیب، دانشمندان می توانند یک جهش عامل بیماری را با یک توالی سالم جایگزین کنند یا تغییرات دیگری در ژنوم انجام دهند.

ویرایش ژن CRISPR

ویرایش ژن CRISPR (تلفظ /ˈkrɪspər/ “crisper”) یک تکنیک مهندسی ژنتیک در زیست شناسی مولکولی است که توسط آن ژنوم موجودات زنده ممکن است اصلاح شوند. با فرستادن نوکلئاز Cas9 کمپلکس شده با یک RNA راهنمای سنتز شده (gRNA) به داخل یک سلول، ژنوم سلول را می‌توان در محل مورد نظر برش داد و به ژن‌های موجود اجازه حذف دادو یا به ژن‌های جدید در داخل بدن اضافه کرد.

سیستم‌های CRISPR-Cas در دنیای پروکاریوتی بسیار رایج هستند، زیرا در حدود نیمی از گونه‌های باکتریایی و باستانی شناخته شده تا به امروز شناسایی شده‌اند . در طبیعت، DNA باکتریایی سیستم CRISPR-Cas9 را کد می کند. اما Cas9 به طور طبیعی در موجودات پیچیده مانند گیاهان یا انسان و همچنین در همه میکروب‌هایی که ممکن است بخواهیم مطالعه کنیم رمزگذاری نشده است، بنابراین محققان باید این سیستم را برای ویرایش ژنوم به این موجودات اضافه کنند یا “deliver” کنند. برای انجام این کار، آنها باید از موانع سلولی عبور کنند. محققان بسته به نوع ارگانیسمی که با آن کار می کنند و دقیقاً چه کاری می خواهند انجام دهند، این موانع را به طرق مختلف دور می زنند.

روش‌های متداول برای افزودن ابزارهای CRISPR به سلول‌ها

انتقال پلاسمیدها (برای باکتری‌ها)،

الکتروپوریشن،

تحریک شیمیایی یا تحویل ویروسی (برای سلول‌های انسانی)،

انتقال آگروباکتریوم (برای گیاهان)،

microinjection  تخم‌ها یا جنین‌ها (برای مدل‌های حیوانیمانند موش یاzebrafish ).

انواع متعددی از سیستم CRISPR-Cas شناخته شده که در بسیاری از جنبه ها مانند ترکیب کمپلکس های Cas-crRNA یا ساختار crRNA ها  با هم متفاوت هستند.

DNA اپرون CRISPR شامل هر دو ناحیه کد کننده و غیر کد کننده پروتئین است که رونویسی و پردازش می شوند تا حداقل سه مولکول RNA را تشکیل دهند .شکل زیر ساختار و نحوه تشکیل این ساختار را به طور اختصار نمایش می دهد.

• mRNA کد کننده Cas 9 که برای تولید Cas 9 (پروتئین مرتبط با CRISPR) ترجمه می شود.
• یک cr-RNA غیر کد کننده (CRISPR RNA) که جایگاه برش را شناسایی می کند.
• یک tracr-RNA غیر کد کننده (trans-activating CRISPR RNA)

ساختار و نحوه تشکیل سه مولکول dna

مراحل ویرایش ژن

به طور کل ویرایش ژن توسط سیستم CRISPR شامل سه مرحله می باشد که در شکل زیر به صورت کلی نشان داده شده است:

ویرایش ژن

1- جستجو:

مولکول CRISPER جایگاه دقیق در DNA هدف را پیدا می کند.

2- برش:

مولکول CRISPER، بخشی از DNA هدف را که در نقطه پیدا شده بر اساس الگو برش می دهد.

3- ویرایش:

یک توالی جدید می تواند اضافه شود وقتیDNA در حال تعمیر است.

نحوه عمل CRISPR

نوکلئازهای CRISPR مانند  Cas9توالی هدف DNA را در یک فرآیند چند مرحله ای پیدا کرده و برش می دهند. هر پروتئین ساختار خاصی دارد – یک شکل یا معماری – که به آن اجازه می دهد کار خود را انجام دهد. یک RNA راهنما هر نوکلئاز CRISPR را به سمت توالی DNA یا RNA هدف هدایت می کند. توجه داشته باشید که از آنجایی که RNA به همان زبان ژنتیکی DNA نوشته می شود، RNA و DNA می توانند با یکدیگر جفت شوند و یک RNA راهنما می تواند با DNA یا RNA مکمل جفت شود.

Cas9 یک پروتئین منفرد و دو لوبی است که از چندین دمین ساخته شده است. Cas9 دو لوبی است که دمین های آن دو لوب را تشکیل می دهند: لوب تشخیص (به اختصار REC) و لوب هسته (NUC). لوب REC برای حمل RNA راهنما مهم است و لوب NUC شامل دو حوزه نوکلئاز مجزا به نام HNH و RuvC است.

HNH و RuvC

برای یافتن جایگاه درست برش ، Cas9-gRNA دنبال توالی DNA مکمل است. اولین گام در فرآیند جستجو، جستجوی یک بخش کوتاهی از DNA است که برای Cas9 برای اتصال اهداف و برش لازم است به نام PAM است. PAM توسط ناحیه ای از نوکلئاز به نام PAM-PID شناسایی می شود. پروتئین Cas9 که به طور گسترده استفاده می شود از باکتری استرپتوکوک پیوژنز، توالی PAM، NGG “” را تشخیص می دهد. سایر نوکلئازهای CRISPR به PAMهای منحصر به فرد متصل می شوند زیرا آمینو اسیدهای متفاوتی در دمین های متصل شونده با PAM دارند.

عملکرد کریسپر تشخیص PMA

پس از اتصال به PAM، Cas9 مارپیچ دوگانه DNA مجاور را باز می کند. اگر RNA راهنما با هدف مطابقت داشته باشد، با رشته DNA مکمل (رشته هدف) جفت می شود. جفت شدن همیشه در یک جهت اتفاق می افتد، از توالی هایی درست در کنار PAM، که به عنوان ناحیه seed شناخته می شود، شروع می شود و تا انتهای RNA راهنما  جفت می شود. gRNA و DNA جفت شده در فضای بین لوب های REC و NUC قرار می گیرند. Cas9 به رشته مخالف یا غیرهدف در یک شیار در امتداد سطح آن متصل است و دو رشته DNA را از هم جدا نگه می دارد. اگر PAM وجود نداشته باشد یا DNA مجاور به طور کامل با RNA راهنما مطابقت نداشته باشد، Cas9 حرکت می کند و در جای دیگری جستجو می کند.

عملکرد کریسپر جفت شدن

اگر Cas9 یک PAM را در کنار ناحیه‌ای از DNA پیدا کند که با RNA راهنمای آن مطابقت دارد، فرآیند برش یا شکافت DNA آغاز می‌شود. به طور کلی، تنها پس از هر 20 نوکلئوتید جفت باز RNA راهنما که با DNA هدف جفت می شود Cas9 برش را ایجاد می کند. زمانی که cas9 به PAM متصل می شود دو رشته DNA  را از هم باز می کند تا sgRNA به توالی DNA مکمل خود وصل شود.

عملکرد کریسپر اتصال کامل

هنگامی که DNA هدف عمدتاً یا به طور کامل با توالی راهنما جفت شد، دامنه HNH در جای خود قرار می گیرد و رشته DNA هدف را قطع می کند. تقریباً بلافاصله پس از آن، دمین RuvC در جایگاه خود برای بریدن رشته DNA غیرهدف قرار می گیرد. دو برش در سه نوکلئوتید دورتر از PAM رخ می دهد.

عملکرد کریسپر برشDNAهدف

معایب استفاده از CRISPR

بدن انسان بسیار پیچیده است، دانشمندان هنوز در حال تکمیل CRISPR هستند و نمی توانند عوارض جانبی ناخواسته را تضمین کنند. نگرانی عمده ای برای اثرات بالقوه “خارج از هدف” وجود دارد، جایی که    CRISPR، DNA را در مکان دیگری برش می دهد و منجر به ویرایش یک ژن ناخواسته می شود. بریدگی در محل نامناسب ژنوم، می تواند منجر به جهش با اثرات جدی برای فرد شود. در هر آزمایش ویرایش ژنوم، عملکرد ویرایش می تواند تحت تأثیر عوامل متعددی قرار گیرد و به طور جدی تلاش های شما را مختل کند. عملکرد ویرایش اساساً تعداد سلول‌هایی است که در ظرف کشت با موفقیت ویرایش شده‌اند.

از آنجایی که تغییرات ژنومی می‌تواند در سلول‌های تولید مثلی (سلول‌هایی که اطلاعات ژنتیکی را انتقال می‌دهند) ایجاد شود، تغییرات ایجاد شده به یک فرد از طریق نسل‌های متوالی منتقل می‌شود. اثرات آن بر نسل های آینده غیرقابل پیش بینی است. ویرایش سلول‌های تخمک یا اسپرم (خط ژرم) به سؤالات اخلاقی متعددی منجر می‌شود، از جمله اینکه آیا انسان باید اجازه داشته باشد از فناوری CRISPR برای افزایش ویژگی‌های مورد نظر (به عنوان مثال: قد، رنگ چشم، هوش) استفاده کند.

کاربردهای فناوری کریسپر

با CRISPR، اختلال هدفمند هر ژن – در بیشتر موجودات – امکان پذیر است. این به دانشمندان اجازه می دهد تا DNA ژنومی را با دقت اصلاح کنند تا اطمینان حاصل شود که هیچ ژن یا توالی دیگری به طور ناخواسته مختل نمی شود. فناوری CRISPR آسان‌تر، سریع‌تر و کم‌هزینه‌تر از سایر تکنیک‌های ویرایش ژن است و می‌توان از آن برای ویرایش چندین ژن به طور همزمان در یک سلول استفاده کرد. در نهایت، CRISPR نیاز به معرفی تنها یک پروتئین (Cas9) و یک sgRNA به یک سلول دارد. می توان انتظار داشت که چنین فناوری قدرتمندی طیف وسیعی از کاربردها را داشته باشد. در حال حاضر این فناوری به طور گسترده در مهندسی زیستی استفاده می شود، از بیان ساده فنوتیپ تا پیشرفته ترین هدف گیری سرطان در ژنوم انسان.

کاربرد کریسپر در علوم زیستی

CRISPR را می توان در زمینه انرژی های تجدیدپذیر و کشاورزی نیز استفاده کرد. CRISPR را می توان برای اصلاح سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی استفاده کرد.

• کاربرد کریسپر در درمان

محققان به CRISPR به عنوان تکنیکی برای ویرایش نقایص ژنتیکی نگاه می کنند که منجر به بیماری سلول داسی شکل، فیبروز کیستیک، هموفیلی و دیستروفی عضلانی می شود و برای توسعه درمان های هدفمندتر و موثرتر سرطان استفاده می شوند. یک مطالعه نشان داد که موش های بالغ مهندسی شده برای داشتن یک نوع ژنتیکی کوری می توانند با استفاده از ژن درمانی CRISPR درمان شوند (Berry et al. 2019). هدف این است که روزی سلول های بیمار بیماران برداشته شده، با CRISPR “تثبیت” شوند و سپس برای درمان شرایط مختلف به بدن آنها بازگردانده شود یا اندام های بیمار مستقیماً با CRISPR درمان شوند.

• کاربرد CRISPR برای ویرایش ژنوم:

– ژنتیک در مقابل اصلاح غیر ژنتیکی / سلول های جنینی

– برنامه ریزی مجدد سلول های سوماتیک

– درمان سرطان

– بیماری ارثی

– بیماری های خونی مانند سلول های بیمار، هموفیلی

– بیماری عفونی

• کاربرد کریسپر در کشاورزی

انتظار می رود فناوری CRISPR توسعه محصولات جدید و بهبود یافته را تسریع کند. این فناوری محصولات و دام هایی را با ویژگی های مطلوبی مانند رشد سریع تر، محتوای مواد مغذی بالاتر و مقاومت در برابر بیماری ها تولید کرده است.

• کاربرد کریسپر در صنعت

دانشمندان از سیستم اصلاح شده CRISPR-Cas9 برای ایجاد یک سویه مخمر برای تولید لیپیدها و پلیمرها استفاده کرده اند. این مولکول ها می توانند در توسعه سوخت های زیستی، چسب ها و عطرها مفید باشند. در حال حاضر، این لیپیدها و پلیمرها به صورت مصنوعی از مواد مبتنی بر نفت غیر قابل تجدید ساخته می‌شوند که گران‌تر هستند و می‌توانند خطرات ایمنی را به همراه داشته باشند.

• کاربرد کریسپر در سلامت عمومی

دانشمندان در حال آزمایش با استفاده از CRISPR برای مهندسی “gene drives” هستند تا ژن های خاصی را از طریق جمعیتی از آفات حشرات پخش کنند که باعث مرگ یا نابارور شدن آنها می شود. این تکنیک برای از بین بردن پشه‌های حامل عوامل بیماری‌زای انسانی مانند انگل‌های مالاریا یا ویروس زیکا در نظر گرفته می‌شود.