استخراج RNA از نمونه های مختلف
با توجه به اهمیت بررسی ژنوم انواع بیماری ها و روش های متفاوتی که برای آن ها در نظر گرفته شده است ، اما همچنان یکی از روش های مورد استقبال که پایه و اساس بررسی ژنتیک جانداران می باشد و نیز در مقایسه با دیگر روش ها ساده و کم هزینه محسوب می شود همان کیت استخراج RNA به روش ستونی بوده که در اکثر آزمایشگاه ها و موسسات تحقیقی دنیا مورد توجه قرار گرفته و از اهمیت ویژه ای برخوردار است و شرکت های تجاری گونانی در دنیا اقدام به تولید و توزیع این نوع کیت ها در دنیا کرده اند.
درشت مولکول های RNA با وزن مولکولی بالا ، نقش بسیار مهمی تحت عنوان حامل کد های ژنتیکی در برخی از بیماری های ویروسی دارند. این مولکول ها به دلیل واکنش پذیری بالا و نیز مستعد هیدرولیز شدن ، از نظر ساختاری نسبت به DNA پایداری کمتری دارند .
شرکت یکتا تجهیز آزما بعنوان نماینده انحصاری کمپانی Favorgen تایوان، اقدام به توزیع کیت استخراج RNA از نمونه های مختلف کرده است . این کیت دارای یک دستورالعمل استاندارد و چندین دستورالعمل بهینه شده برای نمونه های خاص و متفاوت می باشد .
نمونه های مورد استفاده در کیت استخراج RNA
با استفاده از کیت استخراج RNA از نمونه های مختلف ، می توانید پروسه ی استخراج RNA را از طیف گسترده ای از نمونه ها انجام دهید . شما می توانید از نمونه هایی نظیر خون کامل ، سلول جانوری ، بافت جانوری ، باکتری ، مخمر و بافت پارافینه عمل استخراج RNA را انجام دهید. بعلاوه در مورد نمونه های خاص مانند بافت های گیاهی با خرید محلول YTzol Pure RNA که فرمولاسیونی مشابه با ترایزول دارد و نیز ادغام دو روش ستونی و YTzol pure RNA می توانید با کمترین هزینه و بهینه ترین دستورالعمل جهت استخراج RNA برای نمونه های خاص و گیاهی اقدام کنید. برای دستیابی به دستورالعمل های بهینه شده برای نمونه های متفاوت می توانید به تب دستورالعمل در کیت استخراج RNA مراجعه بفرمایید .
به طور کلی پایه و اساس کار در کیت استخراج RNA روش مبتنی بر ستون می باشد . ویژگی این روش در تمامی برند ها خلوص بالای RNA و مقدار محصول کم است ولی در مقابل با استفاده از محلول ترایزول ، کاربر محصول زیاد و با خلوص کمتری در اختیار دارد. در این مواقع ، پیشنهاد می کنیم برای نمونه هایی که دارای مقدار قابل توجهی RNA هستند از کیت استخراج RNA استفاده کنید ولی اگر نمونه ی شما مقدار RNA کمتری دارد می توانید از محلول ترایزول با نام تجاری YTzol pure RNA استفاده کنید . در صورتیکه نمونه ی شما مقدار RNA کمی دارد و از طرفی درجه ی خلوص برای شما اهمیت دارد میتوانید با استفاده از دستورالعمل بهینه شده از هر دو روش در آزمایش خود استفاده کنید .
راهکار افزایش مقدار محصول RNA
در اینجا به بهینه سازی پروتکل های موجود می پردازیم و جهت افزایش مقدار محصول RNA ، پیشنهاد می شود مراحل زیر را دنبال کنید :
با توجه به اینکه RNA موجود در خون به واسطه ی مقدار بالای Rnase پایداری خیلی کمی نسبت به بافت دارد ، کاربر می بایست برای استخراج RNA از خون ، تا حد امکان از نمونه ی تازه خون استفاده نماید و تا حد امکان از نمونه های فریز شده اجتناب کند . همچنین بهترین اقدام این است که بافی کوت خون را استخراج نماید و سریعا پروسه ی استخراج RNA را آغاز کند و یا اینکه برای بافت قبل از شروع پروسه ی استخراج RNA از بافت ، از محلول RNAlater استفاده کند و پروسه ی استخراج RNA را به زمانی دیگر موکول کند .
نکته بسیار مهم در این فرآیند اجتناب از فریز و یخ زدایی نمونه به صورت متناوب است .
استخراج RNA به روش ستونی
کیت استخراج RNA به روش ستونی یه روش استخراج فاز جامد برای تمیز کردن سریع اسیدنوکلئیک است. در این روش اسیدنوکلئیک تحت شرایط خاصی به فاز جامد سیلیس متصل می شود . در کیت استخراج RNA روش و اساس کار به ترتیب زیر است:
- لیز سلول ها
- اتصال اسیدنوکلئیک به غشای ژل سیلیکا
- شستن اسیدنوکلئیک متصل به غشای سیلیکا
- و شستشوی اسیدنوکلئیک استخراج شده
در مرحله لیز شدن، سلول های یک نمونه با روش لیتیک پردازش می شوند که در واقع همان شکسته شدن غشای سلولی و آزاد شدن اسیدنوکلئیک است.
در مرحله ی اتصال ، یک محلول بافر به همراه اتانول و یا ایزوپروپانول به نمونه اضافه می گردد و فرایند اتصال آغاز می گردد . محلول به یک ستون منتقل می شود و ستون در سانتریفیوژ قرار می گیرد . در سانتریفیوژ در شرایطی که PH و غلظت نمک محلول در وضعیت بهینه ی خود باشد ، اسیدنوکلئیک با عبور از محلول به غشای ژل سیلیکا متصل می شود .
در فرایند شستشو ، یک بافر شستشو به ستون اضافه شده و سپس ستون مجددا” در سانتریفیوژ قرار داده می شود و شستشو آغاز می شود . در فرایند شستشو ، ناخالصی های باقی مانده از غشا خارج و فقط اسیدنوکلئیک متصل به ژل سیلیس باقی می ماند .
در شستشوی مرحله ی آخر ، یک بافر شستشوی دیگر به ستون اضافه می گردد و دوباره ستون را در سانتریفیوژ قرار داده و در این مرحله اسیدنوکلئیک از غشا خارج شده و از انتهای ستون جمع آوری می شود .
