تکنیک SMS در نسل سوم توالی یابی DNA
درتعیین توالی نسل سوم نیاز به واکنش PCR برای آماده سازی نمونه برطرف شده است و این مرحله حذف شده است. همچنین طول قطعات بسیار بلندتر از طول توالی خوانده شده در دیگر متدهای NGS است. طول بلندتر قطعات ، کاهش زمان ، هزینه و همچنین کاهش خطای خوانش از جمله مزایای این متد است. در تکنیک‌های نسل سوم نیازی به تکثیر قطعات DNA نیست. این تکنیک‌ها به SMS نیز شناخته شده هستند و اولین بار توسط Stephen Quake مطرح شدند و سپس توسط شرکت Helicos BioSciences در سطح تجاری ارائه شدند.
روش توالی یابی SMRT یا single molecule real time
در عصر ژنتیک حاضر، معروف ترین تکنولوژی تعیین توالی نسل سوم، پلت فرم (SMRT) شرکت Pacific Biosciences و ماشین توالی‌یاب PacBio است که اساس آن بر مبنای فرایند طبیعی همانندسازی DNA طرح ریزی شده است و کارایی و دقت چشمگیری دارد. با این فناوری مشاهده سنتز DNA در همان زمان وقوع امکان‌پذیر است.
این تکنیک در برگیرنده ی چیپ‌هایی است که دارای یک فیلم فلزی باریک حاوی حفره هایی تحت نام ZMW میباشند و قطر آن ها، دو و نیم نانومتر و گنجایش آنها 20 زپتولیتر میباشد. همچنین در بستر هر چاهک، یک آنزیم DNA پلیمرازمستقر شده است و فرایند پلیمریزاسیون شکل میگیرد.نظارت بر این چاهک‌ها توسط دوربین‌های CCD انجام میگیرید که این امر منجر به تعیین توالی همزمان با سنتز در زمان واقعی میشود.
در مرحله نخست، ژنوم به قطعاتی به طول 1500 جفت باز شکسته و متصل به دو سمت هر قطعه آداپتور میشود. آداپتور مورد استفاده در این متد ، تفاوت منحصربفردی با آداپتورهای مورد استفاده در سایر روش‌ها دارد که به آداپتورهای سنجاق سری معروف هستند و به قطعه مورد نظر متصل می‌شوند قطعه مورد نظر حلقوی میشود. سپس یک پرایمر به هر آداپتورها متصل میشود و در نهایت در داخل هر یک از چاهک‌ها ،واکنش پلیمریزاسیون با استفاده از نوکلئوتیدهایی که هر کدام با رنگ خاصی برچسب گذاری شده اند انجام میشود.
با اتصال نوکلئوتید لیبل دار به محل فعال DNAپلیمراز، رنگ فلورسنت رصد میشود. در این متد از فسفات گامای لیبل دار با مواد فلورسنت استفاده میشود که نتیجه آن وجود فضای مناسب برای طول رشته در حال ساخت است و منجر به افزایش طول توالی خوانده شده میشود. همچنین با جمع شدن نور لیزر، شناسایی فلوروفور آزادشده به ناحیه‌ای بسیار کوچک در انتهای چاهک‌ها محدود میشود و سنتز رشته جدید متناوبا” انجام میگیرد.
در این فرایند تعیین توالی مولکول‌های منفرد را در مدت زمان بسیار کوتاهی انجام پذیر است. از جمله مزایای روش SMRT نسبت به سایر تکنیک‌ها به شرح ذیل است:
- توالی یابی قطعات طولانی.
- کاهش صرف وقت و زمان
- مطالعه و بررسی تک مولکول ها
توالی یابی مناطق هدف
یکی از دغدغه های توالی یابی اسن است که با وجود اینکه توالی یابی ژنوم با تکنیک‌های NGS ژنوم یکی از بهترین روش های شناخته شده است، ولی همچنان در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بالینی در دسترس نیست.
امروزه از پلتفرم های مختلف NGS به منظور ژنتیک اگزوم در بیماری‌هایی که چندین ژن مختلف مستعد برای جهش دارند و یا بدون نقاط هات اسپات برای جهش میباشند، استفاده میشود.
از جمله آیتم هایی که در آن توالی یابی اگزومی پیشنهاد میشود ، فنوتپ‌های نامشخص، فنوتپ‌های هتروژن هستند . همچنین برای توالی‌یابی هدفمند میتوان به بیماری‌های نقص ایمنی و یا سرطان سینه اشاره نمود که به دلیل جهش یک سری ژن در فرد بوجود می آیند.
تولید توالی اولیه
توجه داشته باشید که گاهی همه ی اطلاعات ژنتیکی برای یک موجود زنده در دسترس نیست ، برای این شرایط ، روش تعیین توالی از نو توصیه میشود. این روش برای اولین بار در سال ۲۰۰۷ روی ژنوم پیچیده و هتروزیگوت انگور با ادغام دو روش سنگر و pyrosequencing انجام شد و توالی خوانده شده ی ژنوم پیچیده یوکاریوتی اسمبل شد.
تعیین توالی RNA
از دیگر کاربردهای تعیین توالی ، توالی یابی total RNA است که در تکنولوژی ژنتیکی امروزه بسیار حائز اهمیت بوده است.این توالی شرایط مطالعه ی داشنکندان را گسترده تر و وسیع تر کرده است و میتوان نسخه‌های موجود در سلول شامل RNA های کد کننده و غیر کد کننده را بررسی کرد. از تعیین توالی RNA برای موجوداتی استفاده میشود که طالعات ژنتیکی زیادی از آنها در دسترس نداریم.
توالی یابی تک سلول
توالی یابی تک سلول برای شرایطی توصیه میشود که با کمبود بافت رو به رو هستیم. کمبود بافت ، محقق را برای دستیابی به مقدار کافی از ژنوم محدود میکند ، مانند بافت های سخت توموری که غیر یکنواخت هستند و همراه با سلول های سالم هستند که در این شرایط میتوان توالی یابی تک سلول انجام داد .
توالی یابی DNA و یا RNA آزاد موجود در خون و سایر مایعات بدن
از دیگر کاربردهای توالی یابی که امروزه بعنوان یک روش پیش آگهی دهنده بسیار مورد توجه قرار گرفته و بیماری های کروموزومی قبل از تولد را هشدار میدهد ، توالی یابی DNA و یا RNA موجود در خون و مایعات بدن است. چون مقدار DNA و RNA موجود در خون محدود است ، روش توالی یابی اسیدنوکلئیک آزاد در خون و مایعات بدن این مشکلات را مرتفع کرده است.
مزایا و معایب توالی یابی نسل جدید
در اینجا به جمع بندی و خلاصه نویسی مزایای استفاده از تعیین توالی میپردازیم :
تحولات عظیم در این تکونولوژی که نتیجه آن پوشش دهی بالا در این تکنیک شده است.
مرتفع شدن نیاز بالا به نمونه ژنومی
توالى یابی تک سلولی برای شرایطی که با مقدار محدودی از بافت مواجه هستیم
مقیاس‌پذیری بسیار بالا
دستورالعمل های آماده سازی نمونه سریع و مستقیم
کاهش وقت و زمان
مقرون به صرفه بودن این تکنیک
مهمترین موضوع این متد‌ها تجزیه و تحلیل داده‌ها میباشد که درآزمایش‌های تحقیقاتی انجام پذیر بوده و هنوز در مقطع بالینی برای کاربرد مداوم نیاز به جای کار دارد و وسعت کارایی آن در سطح بالینی همچنان محدود است . موضوع بعدی، وضعیت محاسباتی میباشد که متد NGS از دقیق ترین سیستم ها هم مقدم تر است. مطلب مهم دیگری که بسیار حائز اهمیت بوده است، مسائل حقوقی و اخلاقی این سیستم میباشد. البته هنوز به طور کامل به آن و پیامدهای آن نپرداخته شده است ولی پیامدهای قانونی و اخلاقی تعیین توالی و اشتراک گذاری اطلاعات ژنتیکی بسیار زیاد است و باید به طور کامل مورد بررسی قرار بگیرد.
