مزایای تکنیک Hotstart PCR
از مزایای تکنیک Hotstart PCR می توان به نیاز کمتر به جابجایی و کاهش خطر آلودگی اشاره کرد. روش Hotstart PCR اصلاح شده شیمیایی را می توان در دمای اتاق انجام داد که در نهایت با جلوگیری از اتصال پرایمرها به یکدیگر قبل از شروع فرآیند PCR و همچنین محدود کردن پرایمر غیر اختصاصی ، به طور قابل توجهی تشکیل پرایمر-دایمرها کاهش می یابد. به طور مشابه ، Hotstart PCR اتصال پرایمرها به توالی های الگو ، که همسانی کمی دارند و منجر به پرایمینگ اشتباه می شوند را مهار می کند. علاوه بر این می‌توان به بهبود حساسیت واکنش به دلیل شرایط سخت اشاره کرد که در نهایت منجر به افزایش بازده محصول قطعه مورد نظر، می گردد. در Hotstart PCR مبتنی بر آنتی بادی ، آنزیم پلیمراز پس از مرحله دناتوراسیون اولیه در طول فرآیند چرخه واکنش فعال می شود ، بنابراین زمان مورد نیاز کاهش می یابد و درنتیجه ، اختصاصیت واکنش بالا می رود. اصل اساسی روش ها و معرف های Hotstart PCR به این صورت است که ، برای مهار فعالیت آنزیم Hotstart Taq DNA polymerase و یا ترکیب dNTP های اصلاح شده ، در طول تنظیم واکنش تا زمانی که مرحله فعال سازی حرارتی رخ دهد ، طراحی شده اند. مهارتشکیل شدن محصولات غیر اختصاصی PCR ، به ویژه در سیکل های اولیه ، منجر به افزایش قابل توجهی در حساسیت تشخیص ، توسط PCR می شود. این امر در کاربردهای تشخیصی PCR یا RT-PCR از اهمیت بالایی برخوردار است.
محدودیت های Hotstart PCR :
روش Hotstart PCR همانند بقیه روش ها ، محدودیت هایی دارد که باید قبل از اجرای این روش در نظر گرفته شود. Hotstart PCR بر خلاف PCR معمولی نیاز به افزایش دما برای مدت زمان طولانی‌تری دارد ، بنابراین DNA الگو ، بیشتر مستعد آسیب می باشد. همچنین افزایش زمان گرمایش به این معنی است که این روش برای رویه‌های خاصی مانند روش رونویسی معکوس تک لوله‌ای تک بافری که برای انجام مرحله رونویسی معکوس به دمای پایین‌تری نیاز دارد ، سازگاری ندارد. در Hotstart PCR اصلاح شده شیمیایی ، فرآیند تکثیر DNA ، اولاً به دلیل افزایش قابل توجهی در زمان فعال سازی مجدد مورد نیاز برای فعال شدن آنزیم پلیمراز و ثانیاً در صورتیکه طول DNA الگو بیش از حد طولانی باشد ، تحت تأثیر منفی قرار می گیرد. در روش‌های مبتنی بر آنتی‌بادی ، هر آنزیم به آنتی‌بادی متفاوتی نیاز دارد و بنابراین هزینه انجام این روش بالاست.
دو محصول با کیفیت مسترمیکس سایبرگرین | SYBR Green qPCR mastermix و مسترمیکس سوپر سایبرگرین | Super SYBR Green qPCR mastermix ، توسط شرکت یکتا تجهیز آزما ارائه می گردد. هر دو این محصولات حاوی آنزیم هات استارت می باشند ، با این تفاوت که آنزیم هات استارت استفاده شده در SYBR Green qPCR mastermix ، از نوع antibody based بوده و انزیم هات استارت استفاده شده در Super SYBR Green qPCR mastermix از نوع chemical based می باشد. با توجه به مقالات ارائه شده ، استفاده از این مسترمیکس های حاوی آنزیم هات استارت ، جهت جلوگیری از تشکیل پرایمر دایمر و محصولات غیر اختصاصی توصیه می شود.
