آنزیم DNase I
آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز l یا DNase I یک اندونوکلئاز خاص می باشد که تجزیه کروماتین را در طول آپوپتوز سلولی تسهیل می کند. فعالیت آنزیم DNase I برای جلوگیری از تحریک ایمنی مهم است و کاهش فعالیت آن ممکن است منجر به افزایش خطر تولید آنتی‌بادی‌های ضد نوکلئوزومی گردد ، که این موضوع ، مشخصه SLE (Systemic Lupus Erythematosus) می باشد. در غیاب DNase I ، تخریب DNA خارج سلولی به شدت کاهش می یابد و در نتیجه گیرنده های ایمنی حساس به DNA ، فعال می شوند. طبق مطالعات انجام شده، موش هایی که کمبود DNase I دارند، یک فنوتیپ لوپوس مانند با افزایش تیتر آنتی بادی ضد هسته ای و گلومرولونفریت را نشان می دهند. جهش در ژن DNase I انسانی و عوامل غیرفعال کننده DNase I با SLE (لوپوس اریتماتوز سیستمیک یا لوپوس منتشر) مرتبط است.
آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز l، یک پلی پپتید تک گلیکوزیدی است که DNA تک رشته ای و دو رشته ای را تجزیه می کند. به نظر می رسد که این نوکلئاز عامل اصلی فعالیت نوکلئولیتیک روی DNA در سرم می باشد. آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز l ، مسئول تجزیه و تخریب اکثر DNA های در گردشی می باشد که از مرگ سلولی آپوپتوز و نکروز شدن سلول های مرده و همچنین از تله های خارج سلولی نوتروفیل به دست می آیند. علاوه بر نقش این آنزیم در سرم ، DNase I به عنوان یکی از دئوکسی ریبونوکلئازهای مسئول قطعه قطعه شدن DNA در فرآیند آپوپتوز پیشنهاد شده است.
نحوه عملکرد آنزیم DNase I
نحوه عملکرد آنزیم DNase l به این صورت است که ، این آنزیم باعث هیدرولیز پیوند های فسفو دی استر در ساختار DNAمی شود. پیوندهای فسفو دی استر، پیوند دهنده ی نوکلئوتیدهای DNA هستند و با تجزیه و شکستن DNA در فضای خارج سلولی به طور متوسط تترانوکلئوتید هایی با انتهای 5 ‘مونوفسفات و 3’ هیدروکسیل ایجاد می شود.
در موارد بالینی ، با استفاده از نبولایزر(nebulizer) افراد مبتلا به فیبروز کیستیک قادر به استنشاق آنزیم های DNase هستند. آنزیم‌های DNase در پاکسازی مجاری تنفسی بسیار کمک کننده هستند. در اثر تجزیه گلبول‌های سفید تجمع یافته در مخاط ، DNA آزاد می شود که منجر به افزایش چسبندگی مخاط می شود. آنزیم‌های DNase ، با تجزیه DNA و متلاشی کردن مخاطات و موکوس از ریه ، باعث پاکسازی ریه ها و مجاری تنفسی می شوند.
کاربردهای آنزیم DNase I
آنزیم DNase l در بیولوژی مولکولی نیز مورد استفاده قرار می گیرد. برخی از کاربردهای آن در ضمینه مولکولی به شرح زیر می باشد:
- از بین بردن آلودگی DNA از نمونه های RNAاستخراج شده
- Clean-up یا پاکسازی RNA قبل از RT-PCR (مرحله اماده سازی رونویسی معکوس یا ریورس ترنس کریپتاز پی سی آر) و پس از رونویسی در محیط آزمایشگاهی (in vitro)
- (DNase I footprinting) ،شناسایی توالی های اتصال پروتئین روی DNA
- جلوگیری از انباشتگی (clamping) در هنگام رسیدگی به سلول های کشت شده (کشت سلولی)
- ایجاد یک کتابخانه قطعه قطعه شده از توالی های DNA برای واکنش های نوترکیب آزمایشگاهی
نقش آنزیم DNase I در استخراج RNA
در پروسه استخراج RNA ، تقریبا تمام نمونه های RNA استخراج شده دارای مقدار کمی از آلودگی DNA هستند. اگر مقادیر 260/280 و 260/230 شما برای RNA مناسب باشد ، می توانید از RNA برای انجام واکنش PCR نیمه کمی استفاده کنید ( بدون نیاز به استفاده از DNase l ) ؛ اما اگر خواستار کیفیت بالای RNA جهت انجام واکنش Real-time PCR باشید ، استفاده از آنزیم DNase l یک ضرورت به حساب می آید. به طور کلی ، استفاده از آنزیم DNase l بهترین راه برای حذف آلودگی DNA از نمونه های RNA می باشد. با این حال باید قبل از انجام واکنش RT-PCR ، آنزیم DNase l به طور کامل غیر فعال شود تا DNA های تازه سنتز شده را تجزیه نکند.
حجم آنزیم DNase I در فرآیند استخراج RNA
به عنوان یک قانون کلی برای عملکرد آنزیم DNase I، از یک واحد DNase I به ازای هر 1 تا 5 میکروگرم RNA کل یا total RNA در حجم 50 میکرولیتری که به مدت 20 دقیقه در دمای 25+ تا 37+ درجه سانتیگراد انکوبه شده است ، استفاده می شود. پس از مرحله هضم DNase I اضافه شده، انجام یک مرحله تصفیه اضافی RNA از آنزیم DNase I الزامی می باشد. در واقع در این مرحله باید آنزیم DNase l اضافی حذف شود . لازم به ذکر است که ، حذف یا غیر فعال کردن آنزیم DNase l دشوار می باشد و روش های ناخوشایند حذف این آنزیم ممکن است حتی روی یک پارچگی RNA تاثیر منفی بگزارد.
