تکنیک LAMP

تکنیک (LAMP ( Loop-mediated isothermal amplification یا بعبارتی تکثیر هم‌دمای متصل به حلقه یا تکثیر ایزوترمال متصل به حلقه ، یک تکنیک تک‌لوله‌ای برای تکثیر DNA  است. این روش انقلابی در آزمایشگاه های تشخیصی برای تشخیص بیماری های خاص بوده است . همچنین این تکنیک ممکن است با رونویسی معکوس برای شناسایی  RNA نیز ترکیب شود.

روش LAMP

یک روش تکثیرکننده DNA  به صورت ایزوترمال است. برخلاف روش  PCR که بصورت مرحله‌ای و با تغییرات متناوب دما انجام می‌گیرد، تکثیر ایزوترمال در دمای ثابت انجام می‌شود و نیازی به دستگاه ترموسایکلر نیست.

در روش LAMP، توالی هدف در دمای ثابت ۶۰–۶۵ درجه با استفاده از دو یا سه مجموعه پرایمر (آغازگر) و آنزیم Bst DNA polymerase  که علاوه بر فعالیت رونویسی، فعالیت جابجایی رشته بالایی نیز دارد، تکثیر می‌شود. به‌طور معمول، ۴ آغازگر متفاوت برای شناسایی ۶ ناحیه متمایز در ژن هدف مورد استفاده قرار می‌گیرد، که به شدت به ویژگی منجر می شود. یک جفت «آغازگر حلقه ای» اضافی نیز می‌تواند واکنش را بیشتر تسریع کندبا توجه به ماهیت ویژه ی کارکرد این آغازگرها، مقدار DNA تولید شده در روش LAMP  به‌طور خاصی به مراتب بیشتر از از روش PCR است.

در این روش مقدار زیادی رسوب منیزیم پیروفسفات به عنوان محصول جانبی در محلول تولید و سبب ایجاد تیرگی می‌شود. به همین دلیل برای شناسایی محصول تکثیر شده واکنش از روش فتومتری استفاده می‌شود.فتومتری باعث سهولت شناسایی با چشم غیر مسلح به ویژه در واکنش‌هایی با حجم بالا می‌شود. این واکنش می‌تواند به صورت ریل تایم یا در لحظه با  روش فلورسانس (با استفاده از  رنگ‌هایintercalating  مثل SYTO9 ) نیز انجام شود. رنگ‌هایی مثل سایبرگرین می‌توانند برای ایجاد تغییر رنگی که با چشم غیرمسلح قابل مشاهده است و نیازی به تجهیزات گران‌قیمت ندارد، یا برای ایجاد پاسخی که با دقت بیشتری توسط تجهیزات اندازه‌گیری می‌شود، مورد استفاده قرار گیرند.

مولکول‌های رنگ، DNA  را جاگذاری یا به‌طور مستقیم برچسب گذاری می‌کنند که می‌توانند با تعداد نسخه‌هایی که از ابتدا حضور داشتند، همبستگی داشته باشند. از این رو روش LAMP  می‌تواند یک تکنیک کمی هم باشد. تشخیص درون لوله ای تکثیر DNA با استفاده از کلسین بارگذاری شده با منگنز میسر می‌شود. طی واکنش سنتزDNA  به صورت in vitro، کلسین واکنش فلورسانس را با ترکیب منگنز با پیروفسفات شروع می‌کند.علاوه بر این تشخیص آمپلیکون‌های LAMP  با چشم غیرمسلح به توانایی آن‌ها در ترکیب با ss- DNA متصل به طلا و در نتیجه جلوگیری از تغییر رنگ قرمز طبیعی به بنفش آبی بستگی دارد که در غیر این صورت با تجمع ناشی از نمک ذرات طلا صورت می‌گیرد؛ بنابراین روشLAMP ترکیب شده با شناسایی آمپلیکون‌ها به وسیله AuNP مزایای بیشتری نسبت به روش‌های قبلی دارد. این مزایا عبارتند از:کاهش زمان تست، تثبیت آمپلیکون با هیبریداسیون و تجهیزات ساده‌تر (مثل عدم نیاز به ترموسایکلر، تجهیزات الکتروفورز و لامپ اشعه ماورای بنفش)

کاربردها و مزایای تکنیک LAMP

LAMPیک تکنیک نسبتاً جدید برای تکثیر DNA است که به خاطر کم هزینه و ساده بودن روش ، می‌تواند مزایای زیادی در آزمایشگاه ها داشته باشد. تکنیک LAMP میتواند  به عنوان یک تست غربالگری ساده در زمینه مراقبت توسط پزشکان مورد استفاده قرار گیرد. از آنجایی که تکنیک LAMP  به صورت ایزوترمال است و نیاز به ترموسایکلر گران‌قیمت درتکنیک PCR معمولی را مرتفع میکند،  همچنین LAMP می تواند یک تکنیک بسیار ارزشمند برای تشخیص بیماری‌های عفونی در کشورهای کم درآمد و متوسط باشد.

LAMP در مقایسه با PCR نسبت به مهارکننده‌های موجود در نمونه‌های پیچیده مثل خون حساسیت کمتر و مقاومت بیشتری دارد و این وجه تمایز به دلیل استفاده ازیک آنزیم  DNA پلیمراز متفاوت بنام آنزیم Bst DNA polymerase است.  گزارش‌های متعدد حاکی از موفقیت‌آمیز بودن تشخیص پاتوژن‌ها در نمونه‌های کمتر فراوری شده مثل خون‌گرم شده یا در حضور نمونه بالینی است. این متمایز بودن تکنیک  LAMP  ممکن است در تنظیمات کم منابع یا کم زمینه مفید باشد، زیرا استخراج DNA  یا RNA متعارف قبل از آزمایش‌های تشخیصی غیرممکن است.

محدودیت های تکنیک LAMP

تکنیک LAMP در مقایسه با متداول ترین روش تکثیر DNA ( PCR)  بطور ویژه ای یک روش تشخیصی مفید تلقی می‌شود ولی برای کلونینگ و هزاران کاربرد زیست‌شناسی مولکولی که با   PCR انجام می‌شوند، ناکارآمد است؛ زیرا در روش  LAMP از ۴یا۶ پرایمر استفاده می‌شود که ۶ یا ۸ ناحیه را در یک بخش نسبتاً کوچک از ژنوم، هدف قرار می‌دهد و چون طراحی پرایمر محدودیت‌های زیادی دارد، طراحی آن‌ها با چشم مشکل می‌شود. به‌طور کلی برای کمک به طراحی پرایمر، بسته‌های نرم‌افزاری رایگان یا تجاری مورد استفاده قرار می‌گیرند، گرچه محدودیت‌های طراحی پرایمر به معنای آزادی کمتر در انتخاب توالی هدف نسبت به  PCR است.

رویکردهای  Multiplexing برای LAMP  کمتر از PCR توسعه یافته‌است. تعداد بیشتر پرایمر به ازای هر هدف در LAMP احتمال برهم کنش پرایمر-پرایمر را افزایش می‌دهد. محصول روشLAMP   یک مجموعه به هم پیوسته از منطقه هدف است که باعث ایجاد یک حالت نردبانی روی ژل می‌شود. بر خلافPCR  که یک باند واحد روی ژل تشکیل می‌شود. اگر چه این مسئله هنگام شناسایی اهداف واحد مشکلی ایجاد نمی‌کند، اما برنامه‌های PCR چندگانه سنتیend point  که در آن هویت یک هدف توسط اندازه باند بر روی ژل تعیین می‌شود با LAMP  امکان‌پذیر نیست. Multiplexing در LAMP با انتخاب یک منطقه هدف با توالی محدود و دستیابی به تجزیه قبل از اجرا بر روی ژل انجام می‌شود. به طوری که هر محصول با اندازه خاص خودش مشخص می‌شود. اگرجه این روش باعث پیچیدگی دستورالعمل و طراحی تجربی می‌شود.