سنتز cDNA یا نسخه برداری معکوس از روی رشته های RNA

اولین مرحله بیان ژن رونویسی یا به عبارتی دیگر transcription  نامیده میشود که بخشی از یک رشته RNA از رشته الگوی DNA ساخته می‌شود. این واکنش توسط آنزیمی به نام RNA پلیمراز کاتالیز می‌شود. رشته RNA سنتز شده به صورت موازی، معکوس و مکمل DNA رشته الگو است. بخش‌هایی از رشته ‌DNA که توالی RNA را رمز گذاری می‌کنند، تحت عنوان واحدهای رونویسی شناخته می‌شوند که می‌توانند بیش از یک ژن را در بر داشته باشند.

رونوشت RNA می‌تواند به صورت RNA پیام رسان در مکانیسم‌های سنتز پروتئین استفاده شود یا در سایر مکانیسم‌های متفاوت سلولی وارد عمل شود. RNAهای عملکردی و غیر کد کننده می‌توانند به صورت RNAهای انتقال دهنده یا RNA های ریبوزومی فعالیت کنند یا تبدیل به RNAهای تنظیمی مانند RNAi یا RNA مداخله‌ کننده برای تنظیم بیان ژن و تشکیل هتروکروماتین شوند. هتروکروماتین‌ها ساختاری متراکم از DNA هستند که در این حالت رونویسی از DNA انجام نمی‌شود.

 

نقش فرایند رونویسی در سلول

فرضیه ای وجود دارد مبنی بر اینکه زمانی زندگی بر روی زمین از همانند سازی RNA آغاز شد که این مولکول به عنوان ترکیبی کاتالیتیکی و حمل کننده اطلاعات ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گرفت. همزمان با تکامل موجودات زنده در طول زمان، پروتئین‌ها وظیفه کاتالیزی را بر عهده گرفتند، زیرا آن‌ها با توالی‌ها و ساختار متنوع خود سازگاری بیشتری با فعالیت‌های کاتالیزی داشتند. به همین دلیل، DNA به عنوان یک مولکول جایگزین برای حمل اطلاعات ژنتیکی مورد استفاده سلول‌های موجودات زنده قرار گرفت. مولکول DNA نسبت به RNA از مقاومت و پایداری بیشتری برخوردار است.مکانیسم رونوشت برداری به عنوان رابطی بین دو مولکول قرار گرفت، با این کار برای سلول‌ها امکان استفاده از یک مولکول نوکلئیک اسید پایدار به عنوان حمل کننده اطلاعات ژنتیکی فراهم شد و RNA به صورت بخش مهمی از مکانیسم سنتز پروتئین مورد استفاده قرار گرفت.

جدایی DNA از محل سنتز پروتئین موجب افزایش حفاظت از مواد ژنتیکی در برابر خطاهای بیوشیمیایی و بیوفیزیکی واکنش‌های پیچیده و چند مرحله‌ای سلول میشود. وجود خطا در مولکول‌های RNA احتمال کمی برای بوجود آمدن خطر برای سلول دارد، به این دلیل که این مولکول‌ها طول عمر بسیار کوتاهی دارند، در حالی که هر گونه تغییر در DNA موجب پیدایش جهش‌های ژنتیکی می‌شود که قادرند به صورت ارثی به نسل‌های بعد منتقل شوند. علاوه بر این، فرایند سنتز cDNA  لایه دیگری به تنظیمات پیچیده ژن اضافه کرده است، به خصوص در گونه‌هایی که دارای ژنوم بزرگی هستند و نیاز به تنظیمات زیادی جهت انجام متابولیسم دارند.

در سلول‌های یوکاریوتی، رونویسی نقش برجسته ای در انتقال اطلاعات ژنتیکی از DNA به سیتوپلاسم دارد، به دلیل این که منافذ هسته‌ای برای عبور ریبوزوم‌ها، پروتئین‌ها یا کروموزوم بسیار کوچک هستند. اندازه منافذ هسته‌ای در حدود ۵ تا ۱۰ نانومتر است، در حالی که اندازه و قطر ریبوزوم‌ها ۲۵ تا ۳۰ نانومتر تخمین زده می‌شود و بسیاری از پروتئین‌ها بزرگتر از ۱۰ نانومتر قطر دارند، همچنین قطر کروموزوم‌هایی که به طور کامل متراکم شده‌اند، بیش از ۲۰۰۰ نانومتر محاسبه شده است. بنابراین ماشین اولیه سنتز پروتئین نمی‌تواند وارد هسته شود و رشته‌های DNA نمی‌توانند از هسته خارج شوند.

 

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت سنتز cDNA رجوع کنید.

 

نظام رونویسی

فرایند رونویسی یک تک رشته RNA را از DNA دو رشته‌ای رونوشت برداری ( سنتز cDNA) می‌کند. بنابراین، تنها اطلاعات یکی از رشته‌های DNA به توالی نوکلئوتیدهای RNA منتقل می‌شود. یکی از رشته‌های DNA به نام رشته کد کننده و رشته دیگر به نام رشته غیرکد کننده شناخته می‌شوند. ماشین رونوشت برداری با رشته الگو بر همکنش دارد و یک رشته mRNA که مشابه رشته کد کننده است را تولید می‌کند. نام‌های دیگری که برای رشته الگو مورد استفاده قرار می‌گیرند، شامل رشته آنتی سنس  یا پاد رمز هستند.دو ژن متفاوت روی مولکول DNA یکسان، می‌توانند توالی کد کننده روی رشته‌های متفاوتی داشته باشند.

آغاز رونویسی

این پروسه در کنار عوامل عمومی رونویسی با اتصال یک RNA پلیمراز به ناحیه بالا دست پروموتر محل شروع رونوشت برداری DNA آغاز می‌شود. آنزیم RNA پلیمراز پروکاریوتی برای شروع رونویسی به فاکتور سیگما متصل می‌شود، در حالی که RNA پلیمراز یوکاریوتی می‌تواند با تعدادی از فاکتورهای رونویسی مانند پروتئین‌های فعال کننده و مهار کننده‌ تشکیل پیوند دهد.

بعد از اتصال آنزیم RNA پلیمراز به ناحیه پروموتر، مولکول DNA به صورت دو رشته‌ای باقی‌ می‌ماند. به این بخش کمپلکس بسته بین DNA و RNA پلیمراز می‌گویند. بعد از این مرحله، RNA  پلیمراز با همراهی عوامل رونویسی، بخشی از DNA را باز می‌کند و با نوکلئوتیدهایی که اکنون درون یک کمپلکس باز در معرض قرار گرفته‌اند، برهمکنش می‌دهد. به کمپلکس باز در این مرحله حباب رونویسی می‌گویند.

RNA پلیمراز در طول DNA  حرکت می‌کند تا برای شروع رونویسی، مکان شروع را درون حباب رونویسی پیدا کند. زمانی که مکان شروع رونویسی مشخص شد، اولین دو نوکلئوتید رونوشت RNA به یکدیگر متصل می‌شوند.

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت سنتز cDNA رجوع کنید.

 

فرار از پروموتر

بعد از این که اولین نوکلئوتیدهای رونوشت RNA به یکدیگر متصل شدند، آنزیم وارد فاز ناپایدار می‌شود. در این حالت آنزیم می‌تواند برای تولید اولیه به عمل خود ادامه دهد یا این که DNA را از دو طرف به سمت خودش بکشد تا یک DNA در هم، درون پلیمراز ایجاد شود. اگر RNA پلیمراز پیچ خوردگی‌های بخش پایین دست ‌DNA را باز کند، رونوشت RNA رها می‌شود، زیرا کمپلکس DNAآنزیم RNA پلیمراز به حالت اولیه خود بر می‌گردند. به این حالت آغاز ناهنجاری میگویند که موجب تولید و رها شدن رونوشت‌های کوتاه RNA می‌شود.

زمانی که بخش بالا دست DNA دوباره دچار پیچ خوردگی شود و آنزیم را دور کند، RNA پلیمراز از ناحیه ابتدایی رونویسی شروع به حرکت می‌کند. برهمکنش‌های بین آنزیم و پروموتر شکسته شده و رونوشت ‌RNA به طول ۱۴ تا ۱۵ نوکلئوتید می‌رسد. به این فرایند فرار از پروموتر می‌گویند که با تغییرات برهمکنش‌های پروتئین – پروتئین و DNA – پروتئین همراه است. برخی از فاکتورهای رونویسی آزاد می‌شوند و رونویسی به سمت مرحله طویل شدن به پیش می‌رود.

مرحله طویل شدن رونویسی

زمانی که یک الیگونوکلئوتید کوتاه RNA که بیش از ۱۵ باز دارد، تشکیل شود، آنزیم RNA پلیمراز در طول رشته الگو DNA شروع به پیشروی می‌کند. رونوشت با رشته کدکننده یکسان است و فقط دو تفاوت بین آن‌ها وجود دارد که در ساختمان نوکلئوتید، قند ریبوز به جای دئوکسی ریبوز قرار دارد و بازی که با آدنین جفت می‌شود، به جای تیمین، یوراسیل نام دارد. آنزیم RNA پلیمراز می‌تواند تشکیل پیوند فسفودی استر بین کربن پنجم از یک نوکلئوتید جدید و کربن سوم از آخرین نوکلئوتید موجود در رونوشت را کاتالیز کند.به دلیل این که مولکول RNA یک فسفات آزاد دارد که به کربن پنجم اولین نوکلئوتید متصل  است و یک گروه هیدروکسیل آزاد دارد که به کربن سوم آخرین نوکلئوتید متصل می‌شود، جهت رونوشت RNA را به صورت ’5 به ’۳ بیان می‌کنند.

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت سنتز cDNA رجوع کنید.

 

مرحله اتمام رونویسی

برخلاف همانند سازی DNA که ‌آنزیم DNA پلیمراز به اضافه کردن نوکلئوتیدها ادامه می‌دهد تا زمانی که به انتهای مولکول برسد، در رونویسی، آنزیم باید در مکانی مشخص که توسط فاکتورهای تنظیم بیان ژن تعیین می‌شود، کار خود را تمام کند.در سلول‌های پروکاریوتی خاتمه رونویسی می‌تواند در ناحیه‌ای دو رشته‌ای از RNA یا در طی عمل پروتئینی به نام رو اتفاق بیفتد.روش اول شامل رونویسی از یک منطقه غنی از بازهای گوانین و سیتوزین است و به دنبال آن رشته‌ای از بازهای یوراسیل قرار دارد که پیوند‌های هیدروژنی ضعیف با DNA الگو را تشکیل ‌می‌دهند. منطقه غنی از بازهای گوانین و سیتوزین ‌می‌تواند به خودی خود یک لوپ یا حلقه تشکیل دهد تا یک ساختار  (Hairpin)  را بسازد که آنزیم RNA پلیمراز و سایر فاکتورهای رونویسی را مهار کند. این مرحله، همراه با پیوند‌های ضعیف بین بازهای یوراسیل و رشته DNA الگو، ‌می‌تواند RNA را از ماشین‌ رونویسی دور کند و به خاتمه رونویسی منجر شود. در این فرایند همچنین پروتئینی به نام NusA موثر است.خاتمه رونویسی وابسته به پروتئین رو، شامل اتصال این پروتئین به توالی در RNA رونویسی شده است. این توالی که در پایین دست کدون‌‌های توقف ترجمه قرار دارد، به پروتئین رو اجازه ‌می‌دهد به RNA متصل شود و در امتداد رونوشت حرکت کند، این حرکت یک فعالیت وابسته به ATP  است. هنگا‌می‌ که این پروتئین به آنزیم RNA پلیمراز متوقف شده برخورد کند، به آنزیم متصل شده و باعث ‌می‌شود که رونوشت و عوامل وابسته به رونویسی مرتبط با آن از DNA جدا شوند. خاتمه رونویسی در سلول‌های یوکاریوتی بسیار کمتر شناخته شده است و بیشتر کار‌ها روی مکانیسم‌‌های آنزیم RNA پلیمراز II متمرکز شده است. خاتمه رونویسی در یوکاریوت‌‌ها همچنین با تغییرات پس از رونویسی و پردازشی که قبل از ارسال RNA بالغ به سیتوپلاسم انجام می‌شود، در ارتباط است.

انواع رونوشت‌‌های RNA

به طور کلی، سه نوع رونوشت RNA شناخته شده وجود دارند که شامل RNA پیام رسان یا mRNA و RNA انتقال دهنده یا tRNA و RNA ریبوزومی یا rRNA هستند و هر سه ارتباط نزدیکی با سنتز پروتئین دارند. به طوری که mRNA توالی اسید‌های آمینه را تعیین ‌می‌کند، tRNA و rRNA برای مکانیسم ترجمه کدهای mRNA بسیار اهمیت دارند.

پلیمریزاسیون mRNA از DNA حاوی ژن‌‌های کد کننده پروتئین، توسط RNA پلیمراز II کاتالیز ‌می‌شود. بعضی اوقات، پروتئین‌‌هایی که در کنار هم استفاده ‌می‌شوند، در قالب یک مولکول mRNA طولانی رونویسی ‌می‌شوند و این امر به ویژه در بین پروکاریوت‌‌ها متداول است. توالی‌‌های DNA بالا دست از توالی کدگذاری شامل جایگاه‌‌های اتصال دهنده برای فاکتورهای رونویسی و همچنین عوامل کنترل کننده آن هستند که زمان و مقدار فعالیت رونویسی را تنظیم ‌می‌کنند. سپس mRNA اصلاح و پردازش ‌می‌شود تا رونوشت نهایی که برای ترجمه استفاده ‌می‌شود را فراهم کند.

RNA ریبوزومی تقریباً پنجاه درصد ازRNA  یک سلول را تشکیل ‌می‌دهد و توسط RNA پلیمراز I در نواحی تخصصی هسته به نام هستک رونویسی ‌می‌شود. هستک‌ها مانند ساختار‌های متراکم کروی در اطراف مکان‌هایی که برای rRNA کدگذاری ‌می‌کنند،‌ قرار می‌گیرند. rRNAهای پروکاریوتی از سه نوع مختلف تشکیل شده‌اند، در حالی که RNAهای ریبوزومی در سلول‌های یوکاریوتی از چهار نوع rRNA ساخته شده‌اند که بزرگترین آن‌ها حاوی بیش از 5000 نوکلئوتید است. این مولکول‌‌های RNA ساختار سه بعدی ریبوزوم‌‌ها را تعیین ‌می‌کنند.

RNA  پلیمراز III رونویسی از پیش ساز‌های tRNA در هسته را کاتالیز ‌می‌کند. توالی‌های پروموتر کنترل کننده بیان ژن tRNA ‌می‌توانند اینتراژیک باشند که در داخل توالی رمزگذاری ژن قرار دارند. پیش ساز‌های tRNA تحت اصلاحات گسترده‌ای از جمله  پیرایش قرار می‌گیرند .

tRNA‌‌های پروکاریوتی، فعالیت کاتالیزوری خود را حفظ کرده و ‌می‌توانند خود فعالیت پیرایشی را انجام دهند، در حالی که اصلاح پس از رونویسی tRNA‌‌های یوکاریوتی توسط آنزیم‌‌های ویژه  اندونوکلئاز انجام ‌می‌شود. این اندونوکلئاز‌ها موتیف ساختاری خاصی را در tRNA شناسایی می‌کنند که توالی هدف برای فرایند پیرایش را تشخیص ‌می‌دهد.

علاوه بر این سه نوع RNA، سلول حاوی تعدادی از RNAهای کوچکتر است که در فعالیت‌های مختلف سلولی نقش دارند. این‌ فعالیت‌ها شامل:

  • تنظیم ژن:با واسطه  micro RNA  و توالی‌هایی در مناطق غیرقابل ترجمه ’۵ از رونوشت mRNA، ژن‌ها تنظیم می‌شوند.
  • اصلاح پس از رونویسی: با عملکرد RNA هسته‌ای کوچک و RNA هستکی کوچک صورت می‌گیرد.
  • دفاع ژنوم: توسط فعالیت‌های RNA تعامل کننده با پی وی و کریسپر انجام می‌شود.
  • حفظ ساختار ژنو‌می: تلومر‌ها و رونوشت‌های RNA‌ای که کروموزوم‌های X را غیرفعال ‌می‌کنند، ساختار ژنومی را حفظ می‌کنند.

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت سنتز cDNA رجوع کنید.

 

تفاوت‌های بین رونویسی در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها

تفاوت مهم بین رونویسی در یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌ها وجود غشای هسته در یوکاریوت‌ها است. رونوشت RNA یوکاریوتی لازم است که به خارج از هسته ارسال شود، در حالی که پروکاریوت‌ها فرایند رونویسی و ترجمه و سنتز پروتئین را در سیتوپلاسم انجام می‌دهند. هر دو مکانیسم می‌توانند در یک مکان انجام شوند، زیرا رونویسی پروکاریوتی دستخوش تغییرات و اصلاحات قرار نمی‌گیرد و پروکاریوت‌ها برای شروع فرایند نیاز به فاکتورهای رونویسی ندارند. بنابراین، مکانیسم رونویسی در پروکاریوت‌ها ساده‌تر انجام می‌شود و می‌تواند همزمان با فعالیت آنزیم‌های فرایند ترجمه، صورت گیرد.

سلول‌های پروکاریوتی تنها یک نوع آنزیم RNA پلیمراز دارند که در تمام واکنش‌های رونویسی سلول وظیفه کاتالیز را بر عهده دارد و در این سلول‌ها یک RNA منفرد می‌تواند مستقیما به چندین پروتئین ترجمه شود. این mRNAها به عنوان رونوشت‌های پلی سیترونیک شناخته می‌شوند. اغلب همه ژن‌های درگیر در یک مسیر بیوشیمیایی با یکدیگر رونویسی و ترجمه می‌شوند.

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت سنتز cDNA رجوع کنید.