تکنیک Hot start PCR

تکنیک Hot start PCR ، روش اصلاح شده و بهینه شده واکنش PCR معمولی می باشد که با محدود کردن یکی از معرف‌ها تا مرحله گرمایش PCR ، اتصالات غیراختصاصی را کاهش می‌دهد. نتایج این روش ، هم از نظر پزشکی و هم صنعتی کاربردهای زیادی دارد. به عنوان مثال، کاربردهای PCR شامل پزشکی قانونی، آزمایش پدری ، شبیه سازی ، تشخیص جهش ، آزمایش ژنتیکی و تعیین توالی DNA را می توان نام برد. اتصالات غیر اختصاصی مشکل اصلی در هر کدام از واکنش های PCR است. اتصالات غیر اختصاصی احتمال نتایج نادرست را افزایش می دهد. PCR در ابتدا توسط  Kary Mullis و همکارش در سال 1989 توسعه پیدا کرد. PCR ، فرآیند همانندسازی در شرایط آزمایشگاهی می باشد که باعث تولید چندین نسخه از DNA  الگو با استفاده از آنزیم Taq DNA polymerase می گردد. دلایل متعددی وجود دارد که چرا اتصالات غیر اختصاصی در واکنش PCR رخ می دهد. در متن زیر، به چندین مورد از آن اشاره شده است:

  • اگر annealing temperature واکنش کمتر از original annealing temperature اولیه باشد ، منجر به اتصال‌های غیر اختصاصی می‌شود.
  • اگر پرایمر در چندین مکان به ژنوم متصل شود، ممکن است بیش از یک قطعه از DNA الگو را تکثیر کند و بیش از یک باند ایجاد شود.
  • غلظت پرایمر عامل دیگری است که اتصالات غیر اختصاصی را تسهیل می کند. اگر غلظت پرایمرها بیشتر از محدوده مورد نظر باشد ، پرایمر به غیر از محل اتصال مخصوص خود ، روی DNA الگو متصل می شود و منجر به اتصالات غیر اختصاصی می شود.
  • غلظت بالاتر مواد افزودنی PCR : غلظت بالاتر هر یک از مواد افزودنی مانند MgCl2 ، KCl ، DMSO یا سایر موارد ، اتصالات غیر اختصاصی را تسهیل می کند.

زمان آماده سازی واکنش ، عامل اصلی در ایجاد اتصالات غیر اختصاصی می باشد. آنزیم Taq DNA polymerase به طور فعال در امپلیفای کردن غیر اختصاصی (non-specific amplification) در دمای اتاق ، شرکت می کند. به دلیل واکنش پذیری اولیه Taq DNA polymerase حتی در صورتیکه واکنش روی یخ انجام گیرد ، می تواند باعث اتصالات غیر اختصاصی گردد. تمام اجزاء واکنش  PCR مانند dNTP ها، الگوی  DNA، افزودنی های PCR و پرایمرها در میکروتیوب PCR وجود دارند ، Taq  به طور فعال با افزودن dNTP به صورت تصادفی فرآیند سنتز را ، قبل از قرار گرفتن آن در دستگاه PCR ، آغاز می کند. به دلیل اتصالات غیر اختصاصی ، بازده نتیجه اصلی و همچنین آمپلیکون هدف ما کاهش می یابد. به همین دلیل است که نتایج در کاربردهای پایین دستی مانند تعیین توالی DNA و هضم محدود (restriction digestion ) با ارزش نیستند. با طراحی واکنش Hot start PCR می توانیم از اتصالات غیر اختصاصی جلوگیری کنیم. هدف از Hot start PCR محدود کردن واکنش در مراحل اولیه ، با محدود کردن آنزیم Taq DNA polymerase در واکنش می باشد.

راه های مختلفی برای جلوگیری از اتصالات غیر اختصاصی در واکنش PCR  وجود دارد که عبارتند از:

  •  استفاده از آنتی بادی های متصل با آنزیم (enzyme-linked antibodies) :

استفاده از آنتی بادی های متصل به آنزیم از جدیدترین راه های غیرفعال کردن آنزیم  Taq DNA polymerase می باشد. در این روش ، آنزیم Taq DNA polymerase به آنتی بادی مخصوص مرتبط و به آن متصل می شود و باعث غیرفعال شدن آن می گردد. از این رو آنزیم Taq DNA polymerase در مراحل اولیه واکنش ، قبل از شروع PCR ، قادر به تکثیر  DNA نمی باشد. روش کار به این صورت است که ، آنتی بادی مورد استفاده در این روش به دما حساس می باشد و با افزایش دما ، آنتی بادی تجزیه و از بین می رود، در نتیجه آنزیم Taq DNA polymerase در واکنش آزاد شده و فعالیت خود را با سنتز DNA الگو آغاز می کند. محدودیت روش آنزیم متصل به آنتی بادی ، هزینه واکنش می باشد. استفاده از آنتی بادی ، هزینه کلی واکنش را افزایش می دهد. همچنین هر بار برای آنزیم های مختلف ، انواع مختلفی از آنتی بادی مورد نیاز می باشد.

  • مرحله پیش گرم کردن (preheating) دستگاه PCR :

در این روش ، تمام واکنش در دمای 4 درجه سانتیگراد روی یخ آماده می شود و بلافاصله میکروتیوب ها در دستگاه PCR ، که قبلا در دمای 95 درجه سانتی گراد گرم شده است ، قرار می گیرند. این کار باعث کاهش احتمال فعال شدن آنزیم Taq DNA polymerase  می شود.

  • انجماد واکنش PCR :

روش دیگر انجماد عمیق (deep-freezing)  مخلوط PCR می باشد. در این روش ، بلافاصله بعد از اضافه شدن dNTP ها ، پرایمرها ، آب و DNA الگو به میکروتیوب ، مخلوط واکنش منجمد می شود. سپس ، Taq DNA polymerase و مواد افزودنی   PCR  مانند MgCl2 ، بر روی سطح یخ زده واکنش ، اضافه می شوند و نهایتا میکروتیوب ها در دستگاه PCR قرار می گیرند. با انجام این روش از اتصالات غیر اختصاصی جلوگیری می شود.

  • افزودن آنزیم Taq DNA polymerase به طور جداگانه :

در این روش ، پس از آماده شدن مخلوط واکنش (به جز آنزیم) ، میکروتیوب ها در دستگاه PCR قرار می گیرند و هنگامی که دما به 95 درجه سانتیگراد رسید، آنزیم Taq DNA polymerase  به آن ها اضافه می شود. این روش چندان قابل اعتماد نمی باشد ، چراکه بازکردن دستگاه PCR ، احتمال آلودگی و شکست واکنش را افزایش می دهد.

  • (دانه های مومی) Wax beads :

یکی دیگر از روش های جالب Hot start PCR ، استفاده از Wax beads (دانه های مومی) می باشد. دانه های مومی وابسته به دما ، مانعی فیزیکی بین Taq DNA polymerase و سایر اجزای واکنش PCR ایجاد می کنند.  dNPT ها ، آب ، پرایمرها و DNA الگو به انتهای میکروتیوب  اضافه می شوند و به دنبال آن Wax bead اضافه می شود. پس از آن ، آنزیم و سایر معرف‌ها مانند MgCl2 روی سطح Wax bead اضافه می‌شوند. هنگامی که دما به بالاتر از 70 درجه سانتیگراد رسید ، Wax beads (دانه های مومی ) ذوب می شوند و آنزیم Taq DNA polymerase به واکنش اضافه می شود و بلافاصله واکنش شروع می شود. لایه موم سپس در طول مراحل تکثیر به بالای مخلوط واکنش حرکت می کند تا بعداً به عنوان یک مانع بخار عمل کند.

  • الیگونوکلئوتیدهای بسیار اختصاصی :

الیگونوکلئوتیدها ، پلیمرهای کوتاه اسید نوکلئیکی هستند که به راحتی به هم متصل می شوند. الیگونوکلئوتیدهای بسیار اختصاصی ، مانند آپتامرها ، در دماهای پایین تر به آنزیم Taq DNA polymerase متصل می شوند و آنزیم را در مخلوط واکنش غیرفعال می کنند. تنها در دماهای بالاتر، الیگونوکلئوتیدها از آنزیم Taq DNA polymerase جدا می شوند و به آنزیم اجازه شرکت در واکنش را می دهند. در دمای 50 درجه سانتیگراد، آنزیم در حضور الیگونوکلئوتیدهای بسیار اختصاصی غیر فعال می ماند. در دمای بالاتر از 50 درجه سانتیگراد ، الیگونوکلئوتیدها از Taq جدا می شوند و آنزیم در واکنش آزاد می شود.

موارد ذکر شده ، برخی از بهترین روش های مورد استفاده برای  Hot start PCR می باشند. با این وجود ، بهترین روش های سازگارشده برای Hot start PCR ، آنتی بادی متصل به آنزیم ، Wax bead (دانه موم) و روش الیگونوکلئوتیدی اختصاصی می باشند. برای روش‌  Hot start PCR از یک اصلاح‌کننده آنزیم  مانند یک گروه شیمیایی ، آنتی‌بادی ، مولکول Affibody یا آپتامر استفاده می‌کنند. دو مورد از رایج ترین روش های مورد استفاده در Hot start PCR ، اصلاح شیمیایی و آنتی بادی ها هستند. در حالی که همه این روش ها فعالیت آنزیم پلیمراز را در دمای اتاق مهار می کنند، تفاوت های کلیدی بین آنها وجود دارد.