مسترمیکس PCR چیست؟ همه چیز درباره ترکیب و کاربرد آن در تست PCR
مسترمیکس PCR چیست؟
مسترمیکس (Master Mix) یک ترکیب آماده و بهینه‌شده از مواد ضروری برای انجام واکنش‌های زیست‌شناسی مولکولی، به‌ویژه PCR و qPCR است. این مخلوط با هدف کاهش خطای انسانی، افزایش دقت، و بهبود عملکرد واکنش‌ها طراحی شده است.
جهت خرید و قیمت مستر میکس pcr پی سی آر
خرید و قیمت مستر میکس سوپر pcr پی سی آر
ترکیبات اصلی مسترمیکس:
آنزیم پلیمراز (معمولاً Taq Polymerase) برای تکثیر DNA
dNTPs (نوکلئوتیدهای آزاد) به‌عنوان واحدهای سازنده‌ی رشته DNA
بافر واکنش جهت تنظیم pH و ایجاد شرایط ایده‌آل آنزیمی
MgCl₂ (کلرید منیزیم) برای افزایش فعالیت آنزیم پلیمراز
تثبیت‌کننده‌ها و بهبوددهنده‌های عملکرد آنزیم
مزایای مسترمیکس:
کاهش زمان آماده‌سازی و ساده‌سازی مراحل آزمایش
افزایش دقت و کاهش احتمال آلودگی
بهینه‌سازی واکنش برای نتایج دقیق‌تر
مناسب برای طیف وسیعی از کاربردها از جمله تشخیص بیماری‌ها، کلونینگ ژنی، و مطالعات بیان ژن
انواع مسترمیکس PCR:
مسترمیکس‌ها به‌عنوان یک راهکار سریع و کارآمد در آزمایش‌های مولکولی، نقش کلیدی در افزایش دقت و کارایی نتایج دارند.
مستر میکس‌ها (Master Mixes) در تکنیک PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) برای تسهیل و تسریع فرآیند آماده‌سازی نمونه‌ها به کار می‌روند. این مستر میکس‌ها شامل تمامی مواد مورد نیاز برای انجام PCR به جز DNA الگو هستند. بسته به نوع PCR و نیازهای خاص آزمایش، انواع مختلفی از مستر میکس‌ها وجود دارند که در زیر به انواع مختلف آن‌ها اشاره می‌شود:
1. مسترمیکس معمولی PCR
این مستر میکس‌ها شامل تمامی مواد لازم برای انجام PCR، مانند دئاکسی نوکلئوتیدها (dNTPs)، آنزیم پلیمراز، بافر و یون‌های مناسب برای انجام واکنش هستند.
معمولاً برای PCR کلاسیک مورد استفاده قرار می‌گیرند.
به طور معمول نیاز به افزودن پرایمرها و الگوی DNA از پیش آماده‌شده دارید.
کاربرد: استفاده در آزمایش‌های عمومی PCR.
2. مسترمیکس PCR ریل تایم (Real-Time PCR Master Mix)
در این نوع مستر میکس‌ها، به جای استفاده از روش‌های معمول PCR، امکان مشاهده تغییرات در مقدار محصول PCR در حین فرآیند وجود دارد.
این مستر میکس‌ها معمولاً شامل مواد خاصی مانند رنگ‌های فلورسانس (مثلاً SYBR Green یا پروب‌های فلورسانس) هستند که به محض افزایش محصول PCR، سیگنال فلورسانسی تولید می‌کنند.
کاربرد: استفاده در آزمایشات کمی و ریل تایم (برای تعیین میزان بیان ژن یا تشخیص دقیق‌تر).
3. مسترمیکس PCR دوتایی (Double-Strength PCR Master Mix)
این مستر میکس‌ها به صورت دوتایی از تمام اجزاء (مانند dNTPs و پلیمراز) در غلظت بالاتر آماده می‌شوند.
معمولاً برای مواقعی که نیاز به حجم کم‌تر از مواد در هر واکنش دارید استفاده می‌شود. این مستر میکس‌ها ممکن است در برخی آزمایش‌ها مفید واقع شوند که نیاز به کپی بیشتر DNA دارند.
کاربرد: زمانی که مقدار DNA کمی دارید و به حجم بالاتری از مستر میکس نیاز دارید.
4. مسترمیکس PCR برای RT-PCR (Reverse Transcription PCR Master Mix)
این نوع مستر میکس مخصوص RT-PCR است که از آن برای تبدیل RNA به cDNA استفاده می‌شود.
شامل آنزیم معکوس ترنسکریپتاز (Reverse Transcriptase) به همراه دیگر مواد مورد نیاز برای انجام RT-PCR می‌باشد.
کاربرد: بررسی بیان ژن‌ها با استفاده از RNA به عنوان الگو.
5. مسترمیکس PCR داغ (Hot-Start PCR Master Mix)
این نوع مستر میکس به طور خاص طراحی شده تا واکنش‌های PCR در دمای بالا شروع شوند.
آنزیم‌های مورد استفاده در این مستر میکس‌ها به گونه‌ای اصلاح شده‌اند که در دماهای پایین غیرفعال هستند و تنها پس از گرم شدن به دمای بالای PCR فعال می‌شوند.
- جلوگیری از تکثیر غیر اختصاصی در دماهای پایین (تکنیک هات استارت)
- برای مطالعه بیشتر در خصوص این مستر میکس و تکنیک هات استارت به مقاله مزایای تکنیک هات استارت مراجعه نمایید.
کاربرد: کاهش مشکلات غیر اختصاصی مانند اتصال پرایمرها به DNA در دماهای پایین‌تر و جلوگیری از پلیمریزاسیون اولیه غیرهدفمند.
6. مسترمیکس PCR برای Multiplex PCR
این مستر میکس‌ها برای استفاده در Multiplex PCR طراحی شده‌اند که در آن از چندین جفت پرایمر برای هدف قرار دادن چندین ژن یا منطقه مختلف در یک واکنش PCR استفاده می‌شود.
معمولاً این مستر میکس‌ها حاوی ترکیبات ویژه‌ای هستند که تداخل بین پرایمرها را کاهش می‌دهند.
کاربرد: تحلیل همزمان چندین هدف ژنتیکی در یک واکنش PCR.
7. مسترمیکس PCR برای Nested PCR
برای PCRهای چندمرحله‌ای (Nested PCR) طراحی شده‌اند که از دو جفت پرایمر متفاوت در دو واکنش PCR متوالی استفاده می‌کند.
این مستر میکس‌ها معمولاً شامل مواد ویژه‌ای برای دستیابی به حساسیت بالاتر و کاهش احتمال تداخل یا خطا در واکنش‌های متعدد هستند.
کاربرد: برای افزایش دقت و حساسیت در شناسایی DNA یا RNA بسیار کمیاب.
8. مسترمیکس PCR با واکنش‌های حساس (Sensitive PCR Master Mix)
این مستر میکس‌ها به طور خاص برای واکنش‌هایی طراحی شده‌اند که نیاز به حساسیت بسیار بالایی دارند.
معمولاً برای کار با نمونه‌های ژنتیکی که در غلظت‌های پایین وجود دارند یا در صورت وجود مواد مزاحم (مثل مواد پری‌بیوتیک، مواد شیمیایی یا پروتئین‌ها) استفاده می‌شود.
کاربرد: آزمایش‌های حساس که نیاز به تشخیص دقیق و سریع دارند.
نکته:
هر یک از این مستر میکس‌ها به طور خاص برای نوعی از PCR یا نیاز آزمایشگاهی خاص طراحی شده‌اند و بسته به نوع آزمایش و حساسیت مورد نیاز، انتخاب مناسب‌ترین مستر میکس مهم است
تکنیک PCR در بیولوژی مولکولی
تکنیک پی سی آر/ PCR یکی از جدیدترین تکنیک ها در بیولوژی مولکولی می باشد. از نظر اصول عملی، PCR به همانند سازی DNA در سلول ها تشابه دارد و از فرایند طبیعی که در سلول ها رخ می دهد الهام گرفته شده است. در این روش، از روی یک DNA الگو، به کمک آنزیم DNA پلی مراز همانندسازی صورت می گیرد و رشته ی جدید DNA ، بین دو جایگاه اتصال پرایمر(برای مشاهده مقاله اصول طراحی پرایمر کلیک کنید) در طی هر چرخه PCR تکثیر پیدا می کند.
مسترمیکس PCR
PCR Master Mix گاهی اوقات با عنوان Super Mix یا ready Mix شناخته می شود. PCR Master Mix شامل معرف های مورد نیاز برای انجام واکنش PCR در غلظت های بهینه سازی شده می باشد.
مستر میکس معمولا شامل یک آنزیم DNA پلی مراز مقاوم در برابر حرارت، MgCl2، dNTP و بافر مناسب PCR (غالبا با مواد افزودنی اختصاصی/ تقویت کننده) می باشد. استفاده از مستر میکس پی سی آر ریسک آلودگی و خطاهای احتمالی حجم برداری ( pipetting ) را کاهش می دهد و باعث صرف جویی در زمان و جلوگیری از خطاهای احتمالی در ساختن مستر میکس می شود، همچنین استفاده از مستر میکس بر همگنی معرف ها تاثیر مثبتی ایجاد می کند. از مزایای استفاده از مستر میکس این است که محققان بدون نیاز به محاسبه و اضافه کردن مقادیر دقیق آنزیم ها، بافر ها، کوفاکتورها ( معمولا MgCl2 )، آب و dNTP ، تست های مختلفی با غلظت های متفاوت از نمونه های DNA و RNA را تنظیم (setup) می کنند.
مسترمیکس PCR آماده مصرف
در مستر میکس آماده، تمام یا بیشتر معرف های مورد نیاز برای انجام واکنش PCR ، یکبار تهیه شده است و جهت انجام تست، محقق نیاز به آماده سازی مجدد این معرف ها ندارد و فقط کافی است که مقدار مورد نیاز از پرایمرها و پروب ( در صورت نیاز ) و نمونه های DNA ژنومیک ، پلاسمید و یا cDNA و آب (nuclease free water) را به مستر میکس اضافه کند. ممکن است یک یا چند رنگ برای تشخیص فلورسنت از محصول نهایی در qPCR (Real Time quantitative PCR) گنجانده شود.
مستر میکس مورد نیاز برای واکنش Real Time PCR شامل یک ترکیب فلورسنت ( معمولا سایبرگرین ) نیز می باشد. تفاوت در انتخاب مستر میکس، گاهی اوقات می تواند تفاوت در نتایج آزمایشات را توضیح دهد؛ برای مثال می توان به اندازه گیری طول تلومر اشاره کرد.
مسترمیکس مناسب چه ویژگی‌هایی دارد؟
دارا بودن آنزیم DNA پلیمراز با مقاومت بالا به حرارت
dNTPها در غلظت مناسب
بافر بهینه‌شده با MgCl₂
بدون آلودگی آنزیمی یا RNAse
چرا مسترمیکس آماده در آزمایشگاه‌های مدرن ضروری است؟
در محیط‌های پرکار آزمایشگاهی، خطاهای کوچک می‌توانند نتایج را به شدت تحت تأثیر قرار دهند. استفاده از مسترمیکس آماده:
دقت عملکرد آزمایشگاه را افزایش می‌دهد.
زمان تست‌ها را کاهش می‌دهد.
نیاز به تکرار آزمایش را به حداقل می‌رساند.
کاربرد های تخصصی مستر میکس پی سی آر/ PCR Master Mix :
به طور کلی برای انجام یک روند PCR با توان عملیاتی بالا (High-throughput PCR ) و همچنین برای انجام PCR روتین، معمولا از مستر میکس ها استفاده می شود. از مزایای استفاده از مستر میکس همراه با آنزیم DNA پلی مراز هات استارت (Hot start DNA polymerase )، می توان به انجام واکنش Multiplex PCR و همچنین کاهش دایمر پرایمر ها در واکنش PCR اشاره کرد.ممکن است آزمایشگاه ها، نمونه DNA یا RNA را تغییر دهند در حالیکه با اطمینان می توانند به معرف های درون مستر میکس آماده اعتماد کنند و جهت صرفه جویی در زمان و هزینه از آن استفاده نمایند.
محتویات مستر میکس پی سی آر/ PCR Master Mix به صورت زیر می باشد:
- آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت ( معمولا از آنزیم Taq استفاده می شود)
- بافر
- کوفاکتور ( یکی از رایج ترین کوفاکتورهای مورد استفاده در واکنش PCR، کلرید منیزیم MgCl2 می باشد.)
- dNTP
- پرایمرها
- آب (nuclease-free water or PCR-grade water )
- Template
نمونه DNA الگو برای واکنش PCR می تواند ژنومی، پلاسمید و یا cDNA باشد. کیفیت DNA الگو برای انجام PCR بسیار حائز اهمیت است.هر چه DNA الگوی استفاده شده در واکنش PCR خالص تر باشد، دریافت نتایج خوب آسان تر صورت می گیرد. مقدار ایده آل DNA الگو بستگی به منبع شما دارد اما برای نمونه DNA پلاسمید، معمولا بین 1pg-1ng و حدود1ng-1 µg از نمونهDNA ژنومیک، برای هر PCR مورد نیاز است.
بسیاری از مراکز تحقیقاتی، از مستر میکس های پیش ساخته شده، به منظور صرفه جویی در زمان و جلوگیری از خطاهای احتمالی در اندازه گیری استفاده می کنند.
بیشتر مستر میکس های تجاری به نوع PCR و یا PCR ای که با دستگاه ترموسایکلر خاصی سازگار است،متکی می باشند و پیشرفت واکنش بر اساس میزان رنگ فلورسنس موجود در مستر میکس سنجیده می شود.
با توجه به نیاز کاربران در مصارف گوناگون مسترمیکس های آماده، یکتا تجهیز آزما اقدام به ارائه دو محصول با شرایط زیر کرده است :
مستر میکس پی سی آر | PCR MasterMix 2X، که یک محصول آماده شده برای واکنش PCR است که حاوی تمام معرف
های مورد نیاز برای پی سی آر به جز پرایمرها و Template می باشد. مستر میکس پی سی آر/ PCR MasterMix 2X شرکت یکتا تجهیز آزما، حاوی آنزیم DNA پلی مراز Taq با کیفیت بالا و بافری که در یک غلظت 2x بهینه سازی شده است.
مستر میکس سوپر پی سی آر | Super PCR mastermix که علاوه بر آنزیم DNA پلی مراز Taq دارای آنزیم دیگری با قابلیت (proofreading) 3’ → 5’ exonuclease می باشد که حاوی تمام معرف های مورد نیاز به جز پرایمرها و نمونه است.
مزایای کلیدی استفاده از مسترمیکس آماده
| مزیت | توضیح |
|---|---|
| صرفه‌جویی در زمان | نیازی به آماده‌سازی جداگانه‌ی هر جزء نیست. فقط نمونه و پرایمر را اضافه کنید. |
| کاهش خطای انسانی | نسبت‌های دقیق و یکنواخت، مانع از اشتباه در ترکیب مواد می‌شود. |
| افزایش تکرارپذیری | نتایج یکسان در تکرارهای مختلف آزمایش تضمین می‌شود. |
| پایداری بالا | فرموله‌شده برای حفظ عملکرد در دمای بالا یا ذخیره‌سازی طولانی‌مدت. |
| سازگاری با انواع دستگاه‌ها | برای واکنش‌های معمولی PCR یا Real-time PCR قابل استفاده است. |
بهینه سازی مسترمیکس PCR
طبق آخرین نسخه ی بهینه سازی شده مستر میکس یکتا تجهیز آزما در بخش تحقیق و توسعه و انجام آزمایشات لازم در دپارتمان کنترل کیفی این مجموعه ، عملکرد مسترمیکس PCR با امکان تکثیر DNA با غلظت و کیفیت مختلف فراهم شده است.
بعبارتی می توانید در غلظت های بسیار پایین از نمونه الگو (همانند 1ng)، محصول PCR از الگو هدف را داشته باشید. در نتیجه میزان بازدهی واکنش پی سی آر افزایش خواهد یافت.
