استخراج DNA ژنومی از خون

استخراج DNA ژنومی

طی چند دهه اخیر، PCR، نسل بعدی توالی یابی و فناوری Microarray، تحقیقات مبتنی بر خون را به سطح جدیدی رسانده اند. به صورت مدرن از نمونه خون در انگشت نگاری DNA، توالی یابی کل ژنوم، بانک خون تا بیوپسی مایع و بسیاری موارد دیگر به کاربرده می شود. صرف نظر از کاربرد، استخراج DNA خالص ، با کیفیت بالا و بسیار غلیظ از خون کامل یک پیش نیاز ضروری برای موفقیت در این زمینه است.

تکنیکی که برای جداسازی DNA کامل خون انتخاب می‌کنید علاوه بر اینکه بر نتایج شما تأثیر می‌گذارد، بر سهولت گردش کار بیولوژی مولکولی شما نیز اثرگذار است. بنابراین انتخاب روش استخراج می تواند یک چالش باشد. به طور معمول آزمایشگاه ها پروتکل ترجیحی خود را دارند.  تفاوت در پروتکل ها می تواند در دقت مواد مورد استفاده برای لیز سلول ها و جداسازی انتخابی DNA  باشد. به طور تقریبی تمام پروتکل‌های موجود برای جداسازی DNA کامل خون شامل مراحل: لیز سلولی، حذف پروتئین، سایر آلاینده‌ها و RNA، و (در نهایت) بازیابی است.

روش های مختلفی برای استخراج وجود دارد و یکی از این روش ها استخراج ستونی است .یکی از این روش های ستونی شامل استخراج silica-based می باشد.  به طور کل فناوری این سیستم‌های خالص‌سازی DNA ژنومی بر اساس اتصال DNA به سیلیس در شرایط پر نمک است.

مراحل کار در کیت استخراج DNA  ژنومی از خون | Blood Extraction Kit

متد اصلی کار استخراج DNA ژنومی:

متد اصلی استخراج DNA  به روش ستونی و با استفاده از کیت استخراج DNA ژنومی است.

موارد کاربرد: از این روش برای استخراج DNA ژنومی از نمونه خون محیطی استفاده می شود.

اساس روش آزمایش استخراج DNA ژنومی:

این تکنولوژی ابتدا با لیز سلولی و سپس با حذف پروتئینها با  استفاده از chatropic salt  و پروتئیناز K و اتصال DNA به بستر سیلیکانی، سپس شست شوی DNA با اتانول عمل می کند. در نهایت اندازه DNA تخلیص شده تا 50kb ( 20-30kb) می باشد.

از جمله مزایای این روش نسبت به استخراج به روش اشباع نمک، زمان سریعتر انجام این تست است.  

DNA ژنومی را می توان از خون کامل (تازه یا فریز شده)، پلاسما، سرم، بافی کوت، مایعات بدن، لنفوسیت و سلولهای کشت داده شده استخراج کرد.

نمونه مورد نیاز در بخش نمونه گیری: 5 تا 10ml خون محیطی

نوع نمونه مورد نیاز دربخش فنی:  نمونه خون محيطي

مقدار محصول: 100-300 میکرولیتر بافی کوت که به نوع نمونه و تعداد  سلولهای موجود در نمونه بستگی دارد.

ظرف : لوله های فالکن 15ml یکبار مصرف دارای ضد انعقاد K2-EDTA

معیارهای غیرقابل قبول بودن نمونه:

• نمونه لخته باشد.
• در ضد انعقادی بجز EDTA جمع آوری شده باشد.
• حجم کمتر از 5ml

نگهداری نمونه:

 نمونه خون محیطی پیش از استخراج در صورت نگهداری در دمای اتاق 24 ساعت، تا 2 هفته در دمای 4⁰c قابل نگهداری می باشد.

نمونه DNA ژنومی پس از پروسه استخراج DNA ،در باکس های مخصوص میکروتیوب 1.5ml، تا 1 سال در دمای 4⁰c  و تا چندین سال در دمای 20⁰c- قابل نگهداری می باشد.

وسایل و تجهيزات مورد نیاز جهت انجام آزمایشاستخراج DNA از خون :

• میکروفیوژ يخچال دار
• سانتریفيوژ يخچال دار
• نانودراپ
• سمپلر متغیر
• سر سمپلر
• میکروتیوب 5ml
• بن ماری یا هیتر بلاک
• ورتکس
• دستکش یک بار مصرف
• لوله های فالکون 15 میلی لیتری
• باكس مخصوص نگهداري ميكروتيوب 5ml

مواد مصرفی مورد نیاز در انجام آزمایش استخراج DNA  ژنومی به روش ستونی:

• محتویات کیت  Blood Genomic DNA extraction minikit باید در دمای اتاق  15⁰c تا 25⁰c نگهداری شوند.
• RNase A (انتخابی)
• آب مقطر استریل
• اتانول ℅96

فرآیند انجام آزمايش استخراج DNA ژنومی

محتویات کیت استخراج DNA ژنومی:

• BG Buffer (آماده مصرف)
• Wash1 Buffer (قبل از استفاده برای اولین بار، به این بافر 8 میلی لیتر اتانول 96-100% اضافه می کنیم)
• Wash 2 Buffer(قبل از استفاده برای اولین بار، به این بافر 40 میلی لیتر اتانول 96-100% اضافه می کنیم)
• Elution Buffer (بهتر است بافر را قبل از مصرف الیکوت کنیم )
• پروتئیناز کا  11mg که مقدار 1.1ml به آن sterile ddH2O1 اضافه می کنیم
• BG Mini Column
• Collection tube
• Elution Tube

پیش از شروع به کار استخراج DNA ژنومی :

• ابتدا در دفتر استخراج، كاراكترها، كد، تاريخ استخراج، روش استخراج و نام فرد استخراج كننده را ثبت می کنیم.
• به تعداد نمونه ها، میکروتیوب 5ml برداشته و بر روي جدار و درب لوله ها كد و كاراكتر نمونه را مي نويسيم.
• نمونه مورد استفاده خون کامل و یا بافی کوت است .

* تهیه بافی کوت:  برای تهیه بافی کوت خون کامل را با دور  3000rpm بمدت 7 دقیقه یا 800g  به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. مایع سفید رنگ تشکیل شده بین لایه گلبولهای قرمز در پایین و پلاسما در بالا، بافی کوت می باشد. برای جدا کردن لایه بافی کوت بهتر است سرم روی بافی کوت را به آهستگی با پیپت خارج کرده و یا سمپلر 1000 بافی کوت را خارج کنیم. DNA استخراج شده از بافی کوت مقدار 10-5 برابر DNA نسبت به خون کامل خواهد داشت.

• 300µl از بافی کوت به میکروتیوب 5ml منتقل می کنیم.

نکته: اگر حجم نمونه کمتر از 200µl باشد، با استفاده (PBS (HORC-UB-W-22-00 یا سرم فیزیولوژی، به حجم 200µl می رسانیم.

• وقتی بافی کوت برمیداریم نیاز به شستشو با آب مقطر نیست ولی وقتی با مقداری خون برداشته میشود حتما شستشو با آب مقطر انجام میگردد یکبار یا دو بار بستگی به مقدارRBC .(شستشو میتواند در میکروتیوپ و با دور 8000 rpm و به مدت 5 دقیقه انجام شود)
•  در صورتی که نمونه DNA Genomic RNase free مورد نیاز است 4µl از RNase A اضافه کرده و 2 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می کنیم بعد مرحله بعد را انجام می دهیم .در غیر این صورت مرحله شماره 3 را بلافاصه انجام می دهیم.
• 20µl پروتئیناز K (که در یخچال باید نگهداری شود) و 200µl از بافر BG به نمونه ها اضافه کرده ، سپس کامل ورتکس کنید.(نکته : قبل از اضافه کردن BG  حتما نمونه ها  ورتکس شود) سپس به مدت 60-30 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی گراد انکوبه می کنیم تا سلولها لیز شوند .در طی انکوباسیون نمونه ها را هر 10 دقیقه یکبار ورتکس می کنیم.(در صورت غلیظ بودن نمونه را میتوان به دو میکروتیوپ منتقل کرد و ادامه مراحل را انجام داد).
• نمونه ها را اسپین کنید سپس 200µl اتانول 100-96 % اضافه کرده و به مدت 3 ثانیه کاملا ورتکس کنید.(ورتکس در این مرحله خیلی اهمیت دارد).
• نمونه ها را اسپین کنید . برای هر نمونه یک BG Column را روی یک Collection tube قرار می دهیم و نمونه را روی ستون می بریم و با دور 8000rpm به مدت2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.(به هیچ عنوان اگر لخته ای وجود داشت به ستون منتقل نمی کنیم).
• ستونها را روی Collection tubes جدید قرار داده و مقدار 500µl از W1buffer به ستونها اضافه کرده و  با دور 14000rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.(در صورت شفاف نبودن نمونه میتوان این مرحله را تکرار کرد ولی به مدت 1 دقیقه ).
• ستونها را روی Collection tubes جدید قرار داده و (µl 750) Wash buffer به ستونها اضافه کرده و  با دور 14000rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.در صورت شفاف نبودن نمونه میتوان این مرحله را تکرار کرد ولی به مدت 1 دقیقه برای خشک شدن ستونها ، با دور 14000 rpm به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
• ستونها را روی میکروتیوب جدید قرار داده و 200-100 ماکرولیتر از elution buffer یا ddH2O (PH : 7.5-9.0) وسط ستونها ریخته شود و پس از 30- 60  دقیقه با دور 14000rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ شود.

نکته : حجم استاندارد الوشن بافر 200µl می باشد ولی در صورت کم بودن سلول می توان جهت افزایش غلظت DNA، مقدار الوشن بافر را از µl 150-50 کاهش داد.

• نمونه های DNA را در 20– درجه سانتیگراد نگهداری کنید.