کشت سلول و سلول های سرطانی

• پاساژ در فرایند کشت سلولی چیست؟
• تغییر محیط کشت و یا جایگزینی محیط کشت چیست؟
• دو روش اصلی در جداسازی سلول از بافت کدامند؟

در ادامه خواهید خواند…

مراحل  و روند پایه ای کشت سلول:

فرآیندها و مراحل کشت سلولی بسته به نوع سلول و کاربرد متفاوت است. این بخش فرآیندها و روش های کشت سلولی را معرفی می کند. در کشت سلولی  انتخاب خط سلولی مناسب برای آزمایشات شما، مواد مورد نیاز برای  محیط  کشت، انتخاب کشت چسبنده در مقابل کشت سوسپانسیون از موارد دارای اهمیت است.

روش های بدست آوردن سلول

از بانک سلولی

جداسازی سلول ها از بافت دهنده

مراحل کشت سلول

هنگام شروع کشت از سلول های به دست آمده از بانک سلولی، جهت انجام کشت سلولی باید مراحل “ذوب”، “رشد سلولی” و “مشاهده سلول” طی شود.

‌‌هنگامی که بخواهید از بافت جمع‌آوری‌شده از یک اهداکننده استفاده کنید، معمولاً بافت غیرضروری در صورت متصل بودن به آن برداشته می‌شود. دو روش عمده برای جداسازی سلول ها از بافت وجود دارد، explant culture و روش آنزیمی. در روش های آنزیمی، جداسازی سلول ها از بافت مورد نظر با استفاده از محلول آنزیمی پروتئولیتیک انجام می گیرد. در صورت استفاده از آنزیم، آنزیم را رقیق کنید یا واکنش آنزیمی را با بازدارنده واکنش آنزیمی متوقف کنید، سپس مراحل “رشد سلولی” و “مشاهده سلول” را در ادامه انجام دهید. کشت حاصل بعد از این مراحل کشت اولیه نام دارد.در واقع  کشت اولیه به سلول هایی گفته می شود که مستقیماً پس از جداسازی بافت کشت داده شده اند. بعد از کشت، این سلول ها تکثیر و رشد کرده و  به هم می پیوندند ، بدین ترتیب تمام فضای موجود در فلاسک را اشغال می کند که در این مرحله باید به یک ظرف رشد جدید که فضای بیشتری برای رشد و انبساط مداوم سلول ها فراهم می کند، منتقل شوند.

این کشت های اولیه نیمه عمر محدودی داشته و در محیط in vitro برای مدت محدودی حفظ می شوند. از این کشت های اولیه در نهایت بعد از پاساژ دادن یک رده ی سلولی حاصل می شود.

اکثر رده های سلولی بدون نیاز به ماتریکس های خاص و غیره روی فلاسک های کشت رشد می کنند. با این حال، برخی از سلول ها، به ویژه سلول های اولیه، برای تقویت اتصال، تمایز یا رشد سلولی، به رشد روی ماتریکس های ویژه مانند کلاژن نیاز دارند. توصیه می کنیم برای اطلاعات بیشتر در مورد سلول هایی که در حال کشت هستید، حتما مقالات مرتبط با آنها را مطالعه کنید.

معیار انتخاب رده سلولی

از موارد مهم دیگر در کشت سلولی انتخاب رده ی سلولی است.

معیارهای زیر را برای انتخاب رده سلولی مناسب می توان در نظر گرفت:

• گونه ها: رده های سلولی غیر انسانی و غیرپریمات معمولاً محدودیت های ایمنی زیستی کمتری دارند، اما در نهایت آزمایش های شما تعیین کننده است.
• ویژگی های عملکردی: هدف از آزمایش های شما چیست؟ مثلا،رده های سلولی مشتق از کبد و کلیه ممکن است برای آزمایش سمیت مناسب تر باشند.
• رده ی سلولی finit (رده ی سلولی با تعداد محدد تکثیر) یا continues: در حالی که انتخاب از میان رده سلول finit ممکن است برای اینکه عملکرد درست را بیان کنید، گزینه های بیشتری در اختیار شما قرار دهد، رده سلولی continues اغلب ساده تر کلون و حفظ می شوند.
• نرمال یاtransformed: رده های سلولی transformed معمولاً میزان و سرعت رشد بیشتری دارند ، continues بوده و به سرم کمتری در محیط نیاز دارند اما در این رده ها  تغییراتی در فنوتیپ  به دلیل تغییراتی در ژنتیک ایجاد شده است.
• شرایط و ویژگی های رشد: با توجه به میزان سرعت رشد،میزان اشباع و توانایی رشد در سوسپانسیون، به چه چیزهایی نیاز دارید؟ به عنوان مثال، برای بیان یک پروتئین نوترکیب با بیان بالا، ممکن است بخواهید رده ی سلولی ای انتخاب کنید که توانایی رشد بالایی در سوسپانسیون داشته باشد.
• معیارهای دیگر: اگر از رده ی سلولی finit استفاده کنید توجه کنید آیا ذخایر کافی از سلول موجود است؟ بررسی شود که آیا رده سلولی به خوبی شناخته شده است یا خودتان باید شناخت و تاییدیه ها را انجام دهید؟

اگر از یک رده سلولی abnormal استفاده می کنید، آیا یک رده سلولی normal معادل آن را دارید که بتوانید به عنوان کنترل از آن استفاده کنید؟ آیا  رده سلولی پایدار است؟ اگر نه،  آیا می توان آن را  برای آزمایشات خود،کلون، تهیه و نگهداری کرد؟

ذوب شدن

چنانچه سلول از بانک سلولی گرفته شود  ما یک ویال سلول‌های منجمد به‌دست‌آمده از یک بانک سلولی داریم که از یک مخزن نیتروژن مایع یا فریزر (150- درجه سانتی‌گراد) به یک ظرف نگهداری سرد مناسب، به میز آزمایشگاه منتقل می‌شود و در دمای 37 درجه سانتیگراد ذوب می شود. پس از ذوب، سلول ها را سانتریفیوژ کرده و پس از برداشتن مایع رویی، به رسوب حاصل، محیط تازه که در دمای 37درجه سانتی گراد گرم شده است را اضافه می کنیم و با پیپت کردن  رسوب سلولی را در محیط کشت حل می کنیم.در نهایت با استفاده از میکروسکوپ یا شمارنده سلولی تعداد سلول ها را می شماریم.

رشد و گسترش سلولی

برای دستیابی به افزایش تراکم و رشد سلولی ، مقدار محیط تازه مورد نیاز برای دستیابی به تراکم سلولی مورد نظر را بر اساس تعداد سلول های اندازه گیری شده محاسبه کنید.

مشاهده و بررسی سلول ها

پس از  انتقال سلول ها در ظرف کشت جدید، سلول های موجود در ظرف را با میکروسکوپ نوری یا سایر دستگاه ها ی مرتبط مشاهده  و بررسی کنید:

۱)  سلول های زنده وجود دارد.

۲) مطمئن شوید که سلول ها به طور مساوی در ظرف کشت توزیع شده اند.

۳) وجود آلودگی را بررسی کنید.

۴) مورفولوژی سلول را بررسی کنید.

پس از تایید موارد فوق، ظرف کشت سلولی را در انکوباتور CO2 مرطوب شده در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار  دهید و کشت را ادامه دهید.

تغییر محیط کشت

پس از ذوب شدن  و انتقال به یک ظرف کشت، سلول ها در انکوباتور CO2 شروع به رشد می کنند. سلول ها مواد مغذی را در محیط کشت متابولیزه می کنند، بنابراین محیطی که از مواد مغذی تهی شده و با متابولیت ها غنی شده است باید با محیط تازه جایگزین شود. به این فرآیند «تغییر محیط کشت» یا «جایگزینی محیط کشت» می گویند.

قبل از تغییر محیط، ابتدا سلول ها را مشاهده کنید تا بررسی کنید که کشت به طور طبیعی پیش می رود. پس از حذف محیط قدیمی، به سرعت محیط جدید را اضافه کنید تا از بین رفتن سلول ها جلوگیری شود. برخی از سلول ها اگر در محیط  غوطه ور نباشند ممکن است بمیرند، بنابراین مواردی وجود دارد که  هنگام تعویض محیط مقدار کمی از محیط قدیمی باقی می ماند. علاوه بر این، محیط تازه باید از قبل تا دمای 37 درجه سانتی گراد گرم شود تا سلول ها در معرض تغییرات ناگهانی دما قرار نگیرند.

پس از تعویض محیط، سلول ها را برای هر گونه علائم آسیب بررسی کنید. از یک میکروسکوپ برای به دست آوردن تصاویری از کشت استفاده کنید تا ثابت کنید که کشت به خوبی پیش می رود، سپس آن را به انکوباتور برگردانید و مراقب باشید که اختلالات غیرضروری به حداقل برسد.

پاساژ

هنگامی که سلول ها شروع به تکثیر کردند، آنها را قبل از پر شدن ظرف کشت به ظرف های کشت جدید تقسیم و منتقل کنید. به این «پاساژ» می گویند. حالتی که در آن سلول ها رشد کرده اند تا ظرف کشت را پر کنند، “confluent” نامیده می شود. به طور کلی، توصیه می شود که سلول ها زمانی پاساژ داده شوند که  تراکم سلول ها به  تقریباً 70 تا 80 درصد برسد.

• پاساژ سلول های سوسپانسیون:

سوسپانسیون کشت سلولی را در یک لوله جمع آوری کنید و برای جمع آوری سلول ها سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را خارج کرده و و به رسوب مجدداً محیط تازه اضافه کنید. بخشی از سوسپانسیون تازه را بردارید و با کمک تریپان بلو تعداد سلول های زنده را بشمارید. غلظت سلول را محاسبه کنید، و با در نظر گرفتن روش‌های رقیق‌سازی سلولی ، تراکم سلول‌ها را به‌طور مناسب تنظیم کنید و در ظرف جدید قرار دهید.

• پاساژ سلول های چسبنده:

سلول هایی که به سطح ظرف کشت می چسبند باید به نحوی از سطح آن جدا شوند. به طور کلی از پروتئازهایی مانند کلاژناز، دیسپاز و تریپسین استفاده می شود. در مورد تریپسین، فعالیت توسط یون های کلسیم یا منیزیم مهار می شود، بنابراین لازم است محیط حاوی این یون ها قبل از استفاده شسته شود. برعکس، کلاژناز و دیسپاز در حضور یون های کلسیم فعالیت نشان می دهند.ّ

کشت سلولی ابزار مهمی برای دانشمندان زیست پزشکی است و به طور گسترده در آزمایشگاه های دانشگاهی، بیمارستانی و صنعتی انجام می شود. کشت سلول همه ی شرایط را برای کشف مولکول های جدید و عملکرد آنها فراهم می کند.

برای رشد و تمایز در کشت تقریباً همه انواع سلول های سرطانی به تعامل با یک بستر نیاز دارند. اکثر انواع سلول های سرطانی به صورت تک لایه روی پلاستیک یا شیشه رشد می کنند.

اکثر سلول های سرطانی به pH در حدود 7.2-7.4 نیاز است و بنابراین به دلیل تولید محصولات جانبی به هنگام رشد سلولی که منجر به اسیدی شدن محیط می شود، محیط را باید به طور منظم تعویض کرد.

نشانگر pH  که معمولا به محیط اضافه می شود فنل قرمز است که در pH 6.5 زرد ، در pH 7.0 نارنجی ، در pH 7.4  قرمزو در   pH 7.8 بنفش می شود.

در نهایت، سطوح رطوبت به عنوان  علامت تبخیر آب از محیط دارای اهمیت است.به این دلیل که تبخیر منجر به  افزایش غلظت نمک می شود و این افزایش نمک در نهایت می تواند باعث لیز سلولی شود.

توسعه یک کشت فراتر از کشت اولیه منجر به “رده سلولی” می شود. اهمیت رده سلولی در توانایی آن در ارائه منبع تجدیدپذیر سلولی نهفته است.

رده های سلولی سرطانی

اکثر رده های سلولی سرطانی به تعداد نامحدودی تکثیر می شوند و رده های سلولی نامیرا می توانند هزاران بار تقسیم شوند.

برای اینکه یک رده سلولی به سلول های ” continuous ” (به جای “finit”)  تبدیل شود باید  ابتدا به مقدار کمتری در محیط کشت وجود داشته باشد و دارای توانایی تقسیم نامحدود را نیز داشته باشند یا سلول ها باید تحت “transformation.” قرار بگیرند. هنگامی که یک رده سلول جدید ایجاد شد، باید مشخص و تأیید شود که عاری از هرگونه آلودگی است.

روش های اصلی استخراج سلول

سلول ها را می توان از تومورها و کشت دادن آنها به دست آورد. دو روش اصلی برای استخراج سلول استفاده می شود: جداسازی مکانیکی یا آنزیمی برای به دست آوردن یک جمعیت همگن از سلول های مشتق شده از تومور، امکان انتخاب انواع سلول های خاص در جمعیت سلولی جدا شده از طریق روش های مختلف وجود دارد: یک آنتی بادی خاص همراه با بیدهای مغناطیسی، سانتریفیوژ چگالی یا محیط کشت انتخابی. در حال حاضر در تحقیقات زیست پزشکی، به این دلیل  که بدست آوردن سلول های سرطانی ،ایجاد تغییر و حفظ آنها در شرایط آزمایشگاهی آسان تر است، بیشتر آزمایش ها بر روی رده های سلولی سرطانی انجام می پذیرد.

یکی از سوالاتی که در هنگام استفاده از رده های سلولی سرطانی باید در نظر گرفت این است که رده سلولی با چه دقتی سرطان را در in vivo جذب یا تقلید می کند.

ویژگی مهم رده های سلولی سرطانی

یکی دیگر از ویژگی هایی که رده های سلولی سرطانی باید حفظ شود، مشخصات ژنومی تومور اصلی است. پروفایل ژنومی رده های سلولی باقی مانده از تومورهای اصلی مورد بررسی قرار گرفت. Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) یکی از چندین مجموعه داده های ژنومی است. CCLE تقریباً 1000 رده سلولی از 36 نوع سرطان را نشان می دهد.

با وجود تفاوت ها، شباهت های زیادی بین تومورهای اصلی و رده های سلولی حاصل از آنها وجود دارد. به همین دلیل است که رده های سلولی سرطانی به عنوان نماینده تومورهای خاص مورد توجه قرار می گیرند و بنابراین  جهت انجام آزمایشات معتبر هستند. مدل های تجربی در واقع، تومورها و خطوط سلولی در ویژگی های ژنوتیپی و فنوتیپی خاص مشترک هستند.

کشت سلول های نرمال

کشت سلولهای نرمال  امروزه به نسبت رایج است و به دست آوردن سلول های غیرنئوپلاستیک مستقیماً از تومورهای انسانی برای انجام مطالعه امکانپذیر است. کشت سلول های نئوپلاستیک از سلول هاس توموری به طور مستقیم انجام می شود و روش های مختلفی برای این کار وجود دارد. با این حال، اکثر آزمایشات انجام شده با رده های سلولی، رشد یافته از تومورها و اغلب چندین بار در محیط های حاوی سرم و سایر مواد که باعث رشد آنها می شود، پاساژ داده می شود.

رده های سلولی، همانطور که امروزه آنها را می شناسیم، نقش قابل توجهی در تحقیقات سرطان ایفا می کنند. استفاده از رده های سلولی سرطان درک بهتری از بیولوژی تومور و بهبود توسعه دارو را امکان پذیر کرد. نمونه‌هایی از داروهای فرموله‌شده با استفاده از رده‌های سلولی نامیرا عبارتند از: تراستوزوماب (trastuzumab) آزمایش‌شده بر روی کشت‌های سرطان پستان، ایماتینیب (imatinib) آزمایش‌شده روی رده سلولی لوسمی میلوژن.

کشت اولیه از سلولهای سرطانی

کشت‌های اولیه از سلول های سرطانی به عنوان ابزاری قدرتمند برای مطالعه بیولوژی سرطان، بیان ژن، فعال‌سازی انکوژن یا تقویت آن عمل می‌کنند. نمونه های گرفته شده از بیمار در بررسی پاسخ هورمونی و تأثیر شیمی درمانی بر سلول های تومور مفید هستند. با این حال، سلول های اولیه دارای طول عمر محدود و ظرفیت تکثیر محدود هستند ، که منجر به محدودیت در کشت می شود. بسته به اهداف تحقیق، دانشمندان باید مدل مناسب را متناسب با نیازهای آزمایش انتخاب کنند.

در ترکیب با توالی‌یابی نسل بعدی (NGS)، کشت‌های سرطان اولیه یک ابزار امیدوارکننده برای درمان سرطان ایجاد می‌کنند.