مقایسه آنزيم DNA پلیمراز Taq با آنزيم Pfu پلیمراز

برای انجام یک واکنش PCR  به ترکیبات بافر، dNTP، آنزیم DNA  پلیمراز، پرایمرها و DNA Templet  نیازمندیم و این واکنش توسط دستگاه ترموسایکلر انجام می شود.

آنزیم DNA  پلیمراز، با انتخاب نوکلئوتید صحیح ، نوکلئوتید را طی ساخت زنجیره DNA به پرایمر اضافه می کند تا زنجیره DNA ساخته و طویل شود.

به طور کلی، دو دسته از آنزیم های DNA پلیمراز، شامل DNA پلیمرازهای وابسته به DNA و DNA پلیمرازهای وابسته به RNA یا آنزیم ترانس کریتپازهای معکوس (ریورس ترنس کریپتاز)  در فرایند PCR، بر اساس الگوی درنظر گرفته شده مورد استفاده قرار می گیرند.

آنزيم Taq  پلیمراز ،  ابتـدا از  نوعی مایکوباکتریوم گرما دوست به نام  باكتري Thermus aquaticus كه در چشمه هـاي آب گـرم زندگي می کنند اسـتخراج شـده است، این آنزیم به گرما مقاوم است و به منظور تكثير قطعات خاصی از DNA  و واكـنش زنجيرهاي پليمراز (PCR)  استفاده مي گردد.

علت نام گذاری آنزیم Taq استفاده از جنس و گونه ی باکتری  (Thermus aquaticus=Taq) باشد.

این ویژگی پایدار بودن آنزیم به دماهای بالا، این امکان را فراهم می کند که فقط با یک بار اضافه کردن آنزیم در ابتدای واکنش PCR، چرخه های تکثیر DNA  به طور مکرر انجام می شود.

آنزيم DNA پلیمراز Taq  از اولین آنزیم هایی می باشد که قادر است دمای بالای مرحله ی denaturation  را در واکنش  PCR تحمل کند. در دمای 95 درجه سانتی گراد، نیمه عمر این آنزیم  40 دقیقه است.

یکی از نقاط ضعف آنزیم Taq  این است که این آنزیم  فاقد فعالیت تصحیح اگزونوکلئازی ( exonuclease proofreading ) در جهت 3′  به 5′  می باشد و این امر باعث می شود که دقت کار آنزیم پایین بیاید و خطاهای ایجاد شده توسط این آنزیم تصحیح نمی شود. احتمال خطای این آنزیم در حدود یک در ده هزار نوکلئوتید  اندازه گیری شذه است.

امروزه گزینه های دیگری علاوه بر آنزيم DNA پلیمراز Taq برای واکنش PCR وجود دارد. نوع آنزیم پلیمراز استفاده شده در واکنش PCR تاثیر قابل توجهی در فرایند PCR دارد مثلا بر درجه خلوص و مقدار محصول و همچنین  میزان صحیح بودن همانندسازی محصول رونویسی شده، نقش مهمی دارد.

آنزيم Pfu DNA polymerase، آنزیم دیگری از مجموعه  آنزیم های DNA  های پلیمراز مورد استفاده در PCR می باشد در دمای بالا، مقاوم تر از آنزیم Taq  است و همچنین دارای قابلیت تصحیح کنندگی می باشد. این قابلیت باعث پایین آمدن احتمال خطای نوکلئوتیدی می شود.عموما در مواردی که تکثیر DNA جهت تعیین توالی صورت می گیرد، از آنزیمPfu  استفاده می شود.

آنزیم Pfu | آنزیم Pfu DNA polymerase از باکتری Pyrococcus furiosus استخراج شده است و متعلق به خانواده B ازآنزیم های  DNA polymerase می باشد. آنزیم Pfu دارای فعالیت تصحیح کنندگی اگزونوکلئازی ( exonuclease proofreading ) در جهت ‘5 → ‘3  می باشد، به این صورت که در هنگام ساخت DNA از انتهای ‘3 → ‘5 در صورت بروز اشتباه، آنزیم Pfu با فعالیت اگزونوکلئازی خود در جهت  ‘5 → ‘3 ، بلافاصله نوکلئوتیدی که به اشتباه چسبیده است را در انتهای ‘3 رشته DNA جدید حذف می کند. این ویژگی باعث می شود که قطعات DNA تولید شده طی واکنش  PCR توسط  آنزیم Pfu | آنزیم Pfu DNA polymerase ضریب خطای کمتری نسبت به قطعات DNA تولید شده توسط  آنزيم DNA پلیمراز Taq داشته باشند.

آنزیم Pfu  موجود در بازار  معمولاً منجر به میزان خطا ی 1 در 1.3 میلیون جفت باز می شود و هنگام amplify کردن قطعات با اندازه  1kb ، می تواند منجر به ایجاد % 2.6 جهش در محصولات می شود . Pfu کندتر است و معمولاً 1 تا 2 دقیقه زمان در هر چرخه، برای amplify کردن  1kb DNA در 72 درجه سانتی گراد نیاز دارد که این زمان در آنزیم   Fast Pfu DNA Polymerase  شرکت یکتا تجهیز آزما به 15 ثانیه کاهش یافته و منجر به سرعت و عملکرد بهتر آنزیم Pfu شده است. در تصویر ژل رو به رو ، نمونه ای از عملکرد آنزیم   Fast Pfu DNA Polymerase  شرکت یکتا تجهیز آزما مشاهده می شود .

بنابراین در تکنیک هایی که نیاز به صحت و دقت ( high-fidelity ) بیشتری هست و میزان خطا در کمترین حد ممکن باید باشد مانند انگشت نگاری DNA، استفاده از آنزیم Pfu | آنزیم Pfu DNA polymerase نسبت به آنزيم Taq DNA پلیمراز برتری دارد.

برای تکنیک هایی که علاوه بر صحت به سرعت بالا نیاز دارند، بهترین حالت، استفاده ترکیبی از هر دو این آنزیم ها می باشد که، ترکیب صحت بالای آنزیم Pfu و سرعت فعالیت پلیمرازی آنزیم  Taq این مهم را فراهم می سازد.

 

محصولات مرتبط:

آنزیم Taq | مسترمیکس PCR | آنزیم Pfu