ارتباط مستقیم با کارشناس فروش
استخراج دستی DNA
استخراج DNA ژنومی به روش دستی
استخراج DNA ژنومی یکی از مراحل پایه و بسیار مهم در آزمایشگاههای زیستمولکولی است. کیفیت DNA استخراجشده مستقیماً بر نتیجه تکنیکهایی مثل PCR ، کلونینگ مولکولی، هیبریداسیون و آنالیزهای ژنتیکی اثر میگذارد. در روش دستی، هدف این است که با شکستن سلولها، حذف ترکیبات مزاحم و رسوبدادن DNA ، نمونهای با خلوص مناسب و بدون آسیب جدی به دست آید.
استفاده از معرفهای آماده، این فرایند را سریعتر، تکرارپذیرتر و کمخطاتر میکند.
یکی از محصولات مناسب برای این کار، DNApure Reagent است که بهصورت آماده برای جداسازی DNA ژنومی از بافت و نمونههای مایع عرضه میشود و طبق بروشور محصول، استخراج را در حدود ۳۰ تا ۴۰ دقیقه با بازیابی تقریبی ۷۰ تا ۱۰۰ درصد ممکن میکند. همچنین این محصول برای استفاده پژوهشی طراحی شده است.
مشاهده محصول و خرید DNApure Reagent
محلول استخراج DNA
معرفی DNApure Reagent
برای آزمایشگاههایی که به دنبال یک روش دستی اما سریع و قابل اتکا هستند، DNApure Reagent میتواند گزینه مناسبی باشد. این محصول بهصورت آماده مصرف ارائه شده و برای جداسازی DNA ژنومی از بافت و نمونههای مایع طراحی شده است. طبق اطلاعات بروشور، DNA استخراجشده با این روش بدون خالصسازی اضافه میتواند در کاربردهایی مانند Southern analysis، dot blot hybridization، molecular cloning و PCR استفاده شود. این ویژگی باعث میشود محصول نه فقط برای استخراج، بلکه برای ورود سریعتر به مراحل بعدی کار نیز کاربردی باشد. این معرف در حجمهای 20، 50 و 100 میلیلیتر با کدهای YT9091، YT9092 و YT9093 عرضه شده است.
چرا استخراج DNA ژنومی اهمیت دارد؟
DNA ژنومی، نقشه کامل اطلاعات ژنتیکی سلول است. هرقدر استخراج این مولکول با دقت بیشتری انجام شود، مراحل بعدی آزمایش با اطمینان بیشتری پیش خواهد رفت DNA . نامرغوب یا آلوده میتواند باعث مهار آنزیمها، ایجاد باندهای ضعیف در PCR، افت کیفیت نتایج و حتی تکرار کل آزمایش شود. به همین دلیل، انتخاب روش استخراج مناسب و اجرای صحیح مراحل، از خودِ آزمایش نهایی کماهمیتتر نیست.
بیشتر بخوانید “روش های جدید استخراج DNA و RNA آزاد سلولی“
روش دستی استخراج DNA ژنومی چگونه عمل میکند؟
در روش دستی، ابتدا سلولها یا بافت توسط محلول لیزکننده شکسته میشوند تا محتویات داخل سلول آزاد شود. سپس با کمک یک فرمولاسیون مناسب، DNA از سایر اجزای سلولی جدا شده و با افزودن الکل رسوب میکند. پس از سانتریفیوژ و شستوشوی رسوب، DNA در آب بدون نوکلئاز یا بافر مناسب حل میشود و برای آزمایشهای بعدی آماده خواهد بود. در محصول DNApure Reagent، شرکت یکتا تجهیز آزما توضیح میدهد که این ماده یک محلول لیزکننده بر پایه گوانیدین-دترجنت است که امکان رسوبدهی انتخابی DNA از لیزات سلولی را فراهم میکند.
مواد و ملزومات موردنیاز
برای انجام استخراج با این محصول، علاوه بر خود معرف، به چند ماده پایه آزمایشگاهی نیاز دارید. بر این اساس، وجود اتانول ۱۰۰ درصد، اتانول رقیق برای شستوشو و آب بدون نوکلئاز ضروری است. همچنین استفاده از میکروتیوب تمیز، سانتریفیوژ مناسب و پیپت دقیق برای رسیدن به نتیجه مطلوب اهمیت زیادی دارد.
نمونههای قابل استفاده
بر اساس دستورالعمل محصول، این روش برای چند نوع نمونه قابل استفاده است:
• بافت: حدود 10 تا 40 میلیگرم بافت در 1 میلیلیتر DNApure Reagent همگن میشود.
• سلولها: برای حدود ⁷ 10 سلول، 1 میلیلیتر معرف استفاده میشود.
• نمونه مایع: تا 0.1 میلیلیتر نمونه مایع با 1 میلیلیتر معرف قابل پردازش است.
• سلولهای چسبیده در کشت: برای هر 10 سانتیمتر مربع از سطح پلیت، حدود 0.75 تا 1 میلیلیتر معرف پیشنهاد شده است.
روش کار با DNApure Reagent
یکی از نکات مهمی که در این روش دستی استخراج DNA ذکر شده، این است که قبل از استفاده، معرف در 50 درجه سانتیگراد انکوبه شود تا محلول شفاف شود. این مرحله به عملکرد بهتر استخراج کمک میکند. سپس میتوان مراحل کار را بهصورت زیر انجام داد:
1) لیز و همگنسازی نمونه
به نمونه موردنظر، 1 میلیلیتر از DNApure Reagent اضافه کنید. این مقدار برای 10 تا 40 میلیگرم بافت، حدود ⁷ 10 سلول یا 0.1 میلیلیتر نمونه مایع توصیه شده است. در این مرحله، هدف شکستن سلولها و آزادسازی DNA است. برای نمونههای بافتی، همگنسازی کامل اهمیت زیادی دارد تا بازده استخراج کاهش پیدا نکند.
2) انکوباسیون
پس از افزودن معرف، نمونه ابتدا 10 دقیقه در دمای اتاق و سپس 10 دقیقه روی یخ نگهداری میشود. این مرحله به تکمیل لیز و آمادهشدن لیزات برای جداسازی کمک میکند.
3) سانتریفیوژ اولیه
در ادامه، نمونه به مدت 3 دقیقه با سرعت × g 10,000 در دمای اتاق سانتریفیوژ میشود. سپس سوپرناتانت ویسکوز حاصل به یک تیوب تازه منتقل میشود. این کار باعث حذف بخشی از مواد نامحلول و آمادهشدن نمونه برای رسوبدهی DNA خواهد شد.
4) رسوبدهی DNA
برای رسوبدادن DNA، باید به همان حجم معرف مصرفشده، اتانول 100 درصد سرد اضافه شود؛ یعنی به ازای هر 1 میلیلیتر DNApure Reagent، 1 میلیلیتر اتانول 100 درصد. پس از چند بار وارونهکردن تیوب، DNA معمولاً بهصورت یک رسوب کدر قابل مشاهده میشود. این مرحله، قلب جداسازی DNA در روش دستی است.
5) سانتریفیوژ برای جمعآوری رسوب
در این مرحله، نمونه به مدت 2 تا 3 دقیقه با سرعت × g 15,000 در دمای اتاق سانتریفیوژ میشود تا رسوب DNA تهنشین شود. سپس سوپرناتانت دور ریخته میشود.
6) شستوشوی DNA
برای بهبود خلوص، رسوب DNA در دو مرحله با اتانول 70 درصد شسته میشود:
• بار اول با 1 میلیلیتر اتانول 70 درصد
• بار دوم با 0.5 میلیلیتر اتانول 70 درصد
پس از هر شستوشو، نمونه به مدت 1 تا 2 دقیقه با سرعت × g 15,000 سانتریفیوژ شده و سوپرناتانت دور ریخته میشود. این بخش نقش مهمی در حذف ناخالصیها و باقیمانده نمکها دارد.
7) خشککردن و حلسازی DNA
بعد از حذف اتانول، رسوب DNA باید 1 تا 15 دقیقه در تیوب باز در معرض هوا قرار گیرد تا خشک شود. طبق بروشور، خشکشدن بیشازحد رسوب میتواند حلشدن DNA را سختتر کند. در پایان، رسوب در 50 تا 100 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز یا 10mM Tris-HCl حل میشود. محصول نهایی، DNA ژنومی آماده استفاده در مراحل بعدی خواهد بود.
مزایای روش استخراج دستی DNA
روش دستی استخراج DNA ژنومی با استفاده از DNApure Reagent چند مزیت مهم دارد. نخست اینکه معرف بهصورت “آماده مصرف” ارائه میشود و نیاز به آمادهسازی پیچیده محلولهای متعدد را کم میکند. دوم اینکه زمان انجام کار نسبتاً کوتاه است و میتوان در حدود 30 تا 40 دقیقه به نتیجه رسید. سوم اینکه DNA حاصل، طبق بروشور، برای بسیاری از کاربردهای رایج زیستمولکولی مناسب است و نیازی به خالصسازی اضافه ندارد. این ویژگیها محصول را برای آزمایشگاههای آموزشی، تحقیقاتی و روتین بسیار کاربردی میکند.
بیشتر بخوانید “بهترین کیت استخراج DNA و RNA“
ارزیابی DNA استخراجی: چگونه از کیفیت و کمیت مطمئن شویم؟
پس از انجام موفقیتآمیز مراحل استخراج DNA به روش دستی، گام بعدی حیاتی، سنجش دقیق کیفیت و کمیت DNA به دست آمده است. این ارزیابی نه تنها برای اطمینان از صحت و اعتبار نتایج تحقیقات آتی ضروری است، بلکه به درک بهتر محدودیتهای روش دستی و پتانسیل آن برای کاربردهای مختلف کمک میکند.
۱. سنجش کیفیت DNA: معیارهای خلوص
منظور از کیفیت DNA، میزان پاکیزگی آن از آلایندههای احتمالی مانند پروتئینها، RNA، چربیها و نمکهای باقیمانده از محلولهای استخراج است. حضور این مواد میتواند در مراحل بعدی مانند PCR یا توالییابی (Sequencing) اختلال ایجاد کند.
الکتروفورز ژل: تصویری شفاف از سلامت DNA
چرا مهم است؟ این روش به شما یک دید بصری از وضعیت فیزیکی DNA میدهد.
چگونه عمل میکند؟ نمونه DNA به همراه یک “مارکر مولکولی” (DNA Ladder) در ژل آگارز قرار گرفته و تحت میدان الکتریکی، مولکولها بر اساس اندازه تفکیک میشوند.
طیفسنجی UV: ارزیابی علمی خلوص
چرا مهم است؟ این روش، علاوه بر غلظت، شاخصهای دقیقی از خلوص DNA ارائه میدهد.
با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مانند نانودراپ)، نسبت جذب نور در طول موجهای ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر (A260/A280) را اندازهگیری میکنیم. این نسبت، میزان آلودگی پروتئینی را مشخص میکند؛ نسبت ایدهآل بین ۱.۸ تا ۲.۰ است. همچنین، نسبت جذب ۲۶۰ به ۲۳۰ (A260/A230) به ما در مورد وجود آلایندههای شیمیایی مانند نمکها هشدار میدهد و مقدار مطلوب آن بین ۲.۰ تا ۲.۲ میباشد.” استفاده از این مقادیر و نسبتها، اعتبار علمی مقاله شما را افزایش میدهد.
۲. تعیین کمیت DNA: مقدار دقیق برای برنامهریزی
پس از اطمینان از کیفیت، باید مقدار DNA استخراج شده را بدانیم تا بتوانیم آن را برای آزمایشهای بعدی، مانند PCR، با غلظت مناسب تنظیم کنیم.
طیفسنجی UV: محاسبه غلظت
کاربرد: علاوه بر سنجش خلوص، جذب نور در طول موج ۲۶۰ نانومتر (λmax برای DNA) به طور مستقیم با غلظت DNA متناسب است و امکان محاسبه آن را فراهم میکند.
فلورومتری: دقت بالا برای مقادیر کم
چرا ارزشمند است؟ این روش، به ویژه برای نمونههایی با غلظت پایین DNA یا زمانی که حضور RNA و پروتئین نگرانکننده است، دقت بسیار بالاتری نسبت به طیفسنجی دارد.
توضیح ساده: “این تکنیک با استفاده از رنگهای فلورسنت که به DNA متصل میشوند، میزان DNA را اندازهگیری میکند. سیگنال نوری تولید شده، با غلظت DNA متناسب است و نتایج دقیقی حتی برای مقادیر کم DNA ارائه میدهد.”
بیشتر بخوانید “استخراج DNA به روش Salting Out”
نکات مهم برای گرفتن بهترین نتیجه
برای اینکه استخراج DNA با کیفیت بهتری انجام شود، رعایت چند نکته ضروری است. شفافسازی اولیه معرف در 50 درجه را نادیده نگیرید. حجم نمونه را بیش از مقدار توصیهشده انتخاب نکنید، چون باعث کاهش بازده و افزایش ناخالصی میشود. در مرحله انتقال سوپرناتانت، دقت کنید رسوب یا ذرات نامحلول وارد تیوب جدید نشوند. هنگام خشککردن DNA نیز زمان را کنترل کنید؛ رسوبی که بیشازحد خشک شود، بهسختی حل خواهد شد. این نکات مستقیماً با دستورالعمل بروشور محصول همراستا هستند و رعایت آنها کیفیت نهایی DNA را بهتر میکند.
استخراج DNA ژنومی به روش دستی همچنان یکی از روشهای مهم و پرکاربرد در آزمایشگاههای زیستمولکولی است، بهویژه زمانی که کاربر به دنبال روشی ساده، سریع و مقرونبهصرفه باشد. استفاده از DNApure Reagent این فرایند را استانداردتر میکند و با یک پروتکل مشخص، امکان جداسازی DNA از بافت، سلول و نمونههای مایع را فراهم میسازد. این محصول با مکانیسم لیز و رسوبدهی انتخابی DNA، زمان استخراج را کاهش میدهد و DNA حاصل را برای کاربردهایی مانند PCR و کلونینگ مناسب میسازد.
Hجرای دقیق مراحل بروشور، از شفافسازی اولیه معرف تا شستوشوی صحیح و حلسازی نهایی DNA ، برای رسیدن به بهترین نتیجه، اهمیت زیادی دارد.
