واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا فرآیند PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یکی از مهم‌ترین نوآوری‌های زیست‌شناسی مولکولی و از روش های رایج و متعارف آزمایشگاهی ، است که امکان تکثیر مقادیر بسیار کم DNA به مقدار قابل‌توجهی را فراهم می‌کند. این تکنیک، که در دهه 1980 توسط کاری مولیس ابداع شد، انقلابی در تحقیقات ژنتیکی، پزشکی و زیست‌فناوری ایجاد کرد.
فرآیند PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز است که بر گرفته از نام Polymerase Chain Reaction می باشد که روشی مبتنی بر تکثیر قطعه ی مشخصی از DNA است. یکی از مزیت های این روش عدم محدودیت در انتخاب قطعه ی هدف است  و قطعه ی هدف می تواند همه یا بخشی از ژن‌های رمزکننده پروتئین ‌، RNA یا قسمتی از یک بیومارکر یا نشانگر زیستی باشد که در احراز هویت در پزشکی قانونی کاربرد دارد.

بر همین اساس  هدف از فرآیند PCR ، دستیابی به  تعداد انبوه کپی از ناحیه ی هدف می باشد .گام بعدی این فرآیند ، به کار گیری این کپی ها جهت تحقیق ، پژوهش ، تجزیه و تحلیل خصوصیات و یا فازها متفاوت در کلونینگ و همچنین در تعیین توالی ، انتقال به ژل الکتروفورز و درج در پلاسمید می باشد.

به همین علت تکنیک PCR در شاخه های علمی زیست فناوری مانند زیست شناسی مولکولی ، تشخیص پزشکی و نیز در گروه هایی از اکولوژی بسیار حائز اهمیت است.

تعریف و اصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

PCR یا Polymerase Chain Reaction، روشی آزمایشگاهی برای تکثیر بخش‌های خاصی از DNA است. این تکنیک به پژوهشگران اجازه می‌دهد یک توالی مشخص از DNA را در آزمایشگاه در مقیاس زیاد تولید کنند. PCR بر اساس سه مرحله تکرارشونده عمل می‌کند:

1. دناتوراسیون (Denaturation):
   در این مرحله، DNA دو رشته‌ای در دمای بالا (معمولاً 94-98 درجه سانتی‌گراد) حرارت داده می‌شود تا دو رشته آن از هم جدا شوند.
2. اتصال پرایمرها (Annealing):
   دما به حدود 50-65 درجه سانتی‌گراد کاهش می‌یابد تا پرایمرها (قطعات کوتاه DNA مکمل با توالی هدف) به رشته‌های الگو متصل شوند.
3. تکثیر (Extension):
   در دمای حدود 72 درجه سانتی‌گراد، آنزیم DNA پلیمراز از پرایمرها شروع به سنتز رشته جدید DNA می‌کند.

این چرخه‌ها 20 تا 40 بار تکرار می‌شوند و در هر چرخه، تعداد مولکول‌های DNA به صورت نمایی افزایش می‌یابد.

اجزای مورد نیاز برای واکنش PCR

برای انجام PCR، اجزای زیر مورد نیاز است:

1. DNA هدف: قطعه‌ای از DNA که قرار است تکثیر شود.
2. پرایمرها: قطعات کوتاه DNA که به نواحی خاصی از DNA هدف متصل می‌شوند.
3. آنزیم DNA پلیمراز: معمولاً از Taq Polymerase به دلیل پایداری در دماهای بالا استفاده می‌شود.
4. نوکلئوتیدها (dNTPs): بلوک‌های سازنده برای سنتز DNA جدید.
5. بافر واکنش: شرایط شیمیایی مطلوب برای عملکرد آنزیم را فراهم می‌کند.
6. منیزیم کلرید (MgCl₂): کوفاکتور ضروری برای فعالیت آنزیم.

کاربردهای PCR

روش PCR در طیف وسیعی از زمینه‌های علمی و کاربردی به کار می‌رود:

1. پزشکی و تشخیص بیماری‌ها:
   • تشخیص عفونت‌های ویروسی مانند ویروس کرونا، HIV، و هپاتیت.
   • شناسایی جهش‌های ژنتیکی مرتبط با بیماری‌های ارثی.
2. پزشکی قانونی:
   • شناسایی هویت افراد با استفاده از DNA نمونه‌های کوچک مانند مو یا خون.
   • تحلیل DNA در پرونده‌های جنایی.
3. تحقیقات ژنتیکی:
   • تعیین توالی DNA و بررسی تنوع ژنتیکی.
   • مطالعه بیان ژن‌ها در سلول‌ها و بافت‌ها.
4. زیست‌فناوری:
   • تولید گیاهان و موجودات تراریخته.
   • بهینه‌سازی فرآیندهای زیستی با استفاده از اطلاعات ژنتیکی.
5. مطالعات تکاملی و زیست‌محیطی:
   • بررسی تنوع زیستی.
   • مطالعه DNA موجودات منقرض‌شده یا باستانی.

مزایا و محدودیت‌های PCR

مزایا:

• حساسیت بالا: حتی با مقادیر بسیار کم DNA، نتایج دقیق به دست می‌آید.
• سرعت: فرآیند تکثیر در مدت چند ساعت انجام می‌شود.
• انعطاف‌پذیری: می‌توان از آن برای شناسایی توالی‌های متنوع استفاده کرد.

محدودیت‌ها:

• احتمال آلودگی: حتی مقادیر بسیار کوچک DNA خارجی می‌تواند نتایج را تغییر دهد.
• هزینه: تجهیزات و مواد مورد نیاز ممکن است پرهزینه باشند.
• نیاز به دانش اولیه: طراحی صحیح پرایمرها و تنظیم شرایط واکنش نیازمند تجربه است.

پیشرفت‌های اخیر در PCR

توسعه روش‌های پیشرفته‌تر مانند Real-Time PCR و Digital PCR، دقت و کاربردهای این تکنیک را به‌طور چشمگیری افزایش داده است:

• Real-Time PCR: امکان اندازه‌گیری کمی DNA در زمان واقعی را فراهم می‌کند.
• Digital PCR: حساسیت بالاتری برای تشخیص DNA کمیاب یا جهش‌های ژنتیکی دارد.

نقش مسترمیکس در واکنش PCR

استفاده از مسترمیکس تأثیر زیادی بر دقت و کارایی واکنش PCR دارد. برخی از مزایای مسترمیکس عبارتند از:

1. ساده‌سازی آماده‌سازی: مسترمیکس آماده، زمان مورد نیاز برای تنظیم آزمایش را کاهش داده و فرآیند را ساده‌تر می‌کند.
2. کاهش خطا: به دلیل کاهش تعداد مواد و حجم‌هایی که باید به صورت دستی اندازه‌گیری شوند، احتمال خطای انسانی کمتر می‌شود.
3. نتایج قابل اعتمادتر: بهینه‌سازی اجزای مسترمیکس باعث کاهش تغییرپذیری در نتایج بین آزمایش‌ها می‌شود.
4. افزایش بازده: ترکیب دقیق و متناسب اجزا، بازده تکثیر DNA را افزایش می‌دهد.

انواع مسترمیکس‌ها و کاربردها

مسترمیکس‌ها با توجه به نوع آزمایش و نیازهای خاص طراحی می‌شوند. برخی از انواع متداول شامل موارد زیر هستند:

1. مسترمیکس استاندارد PCR: مناسب برای تکثیر DNA عمومی.
2. مسترمیکس Real-Time PCR: برای بررسی بیان ژن و تشخیص کمی DNA.
3. مسترمیکس Hot-Start PCR: که از فعالیت زودهنگام آنزیم جلوگیری می‌کند تا دقت افزایش یابد.
4. مسترمیکس Multiplex PCR: برای تکثیر هم‌زمان چندین توالی هدف.

ارتباط PCR و مسترمیکس در تحقیقات و کاربردها

در آزمایش‌های زیست‌شناسی مولکولی، استفاده از مسترمیکس به‌عنوان راه‌حلی سریع و قابل اعتماد، تأثیر قابل‌توجهی بر بهینه‌سازی PCR داشته است. مسترمیکس‌ها به ویژه در تحقیقات پزشکی (مانند تشخیص عفونت‌ها)، زیست‌فناوری (مانند شناسایی ژن‌های خاص)، و علوم قضایی (مانند تحلیل DNA برای شناسایی هویت) نقش کلیدی ایفا می‌کنند.

ترکیبات اصلی در مسترمیکس PCR

• آنزیم Taq پلیمراز (   Taq DNA polymerase)
• بافر PCR
•  نوکلئوتیدها ( dNTP)
• MgCl2
•  رنگ آبی بروموفنول

آنزیم Taq  پلیمراز ( Taq DNA polymerase)

مبنای مسترمیکس PCR  و نیز اساس کار واکنش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ، آنزیم Taq  پلیمراز می باشد .این آنزیم از باکتری ترموس آکواتیکوس  استخراج می شود . این آنزیم با توجه به شرایط زندگی باکتری ترموس آکوآتیکوس که در دریچه های عمیق اقیانوس ها می باشد ، مقاوت بالایی نسبت به گرما دارند و پایدار هستند. فعالیت این آنزیم تا دمای 70 درجه سانتی گراد پایدار است .  در اینجا توجه شما را به ویژگی های این آنزیم جلب می کنیم :

اولین مورد heat stability  و یا پایداری گرمایی آنزیم Taq  پلیمراز می باشد که در دماهای بالاتر از محیط  برقرار است . از دومین مزیت این آنزیم  Processivity  و یا قدرت پردازش آن است که به حفظ پیوند به سوسترا تا پایان واکنش اطلاق می گردد  و سومین ویژگی این آنزیم fidelity و یا عملکرد صحیح آن  است که همان پیوند صحیح مولکول در جای مناسب خود می باشد  و این ویژگی در پلیمراز ها باعث می شود هر مولکول مکمل در مقابل نوکلئوتید صحیح قرار بگیرد.

نقش پرایمر ها در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

همانطور که آنزیم Taq پلیمراز اساس کار واکنش PCR  است ، پرایمر ها هم نقش بسزایی دارند  و آنزیم Taq پلیمراز فقط با وجود  پرایمر توانایی سنتز رشته جدید را دارد . پرایمرها با ایجاد سر آزاد oH در مجاورت آنزیم  باعث ایجاد یک نقطه شروع برای آن می شود .به طور کلی در هر واکنش PCR دو پرایمر برای اتصال به دو رشته ی DNA لازم است .

شرکت یکتا تجهیز آزما با تولید دو مسترمیکس PCR به  نیاز کاربران پاسخ داده است. مسترمیکس سوپر PCR  که شامل آنزیم Taqplus و خاصیت proof-reading  است که  باعث قوی تر شدن محصول و حساسیت بالای آن شده است . محصول دیگر مسترمیکس PCR با آنزیم Taq پلیمراز است که شامل همه ی جزییات لازم در واکنش PCR می باشد .

مراحل واکنش PCR

مراحل اصلی در یک واکنش PCR در ابتدا شامل دناتوراسیون (Denaturation) است که در دمای 96 درجه سانتی گراد انجام می گیرد که دو رشته ی الگو از هم باز می شوند . سپس  مرحله ی اتصال در دمای بین 55 تا 65 درجه سانتی گراد انجام می گیرد که پرایمر ها به توالی های مکمل خود متصل می شوند . در مرحله ی طویل سازی که در دمای 72 درجه سانتی گراد انجام می شود و آنزیم taq پلیمراز فعال و ساخت رشته جدید صورت می گیرد .

کاربرد و استفاده از  PCR

مواردی که در ذیل به آن ها اشاره شده است ، از مرسوم ترین و رایج ترین کاربردهای  واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) به شمار می روند :

• تحقیق و پژوهش درباره ی عامل ژن‌های تاثیرگذار در یک بیماری
• تحقیق و پژوهش علل بروز بیماری های عفونی
• کمک به تشخیص پزشکی دقیق
• تکثیر یک قطعه از رونوشت ژن ( Reverse Transcriptase PCR )
• جهت احراز هویت در پزشکی قانونی
• مطالعه ی درست تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن ( Real-Time PCR  )
• مطالعه ی تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن در مقایسه با ژن دیگر ( Semi-quantitative PCR )

بهینه سازی مسترمیکس PCR

طبق آخرین نسخه ی بهینه سازی شده مستر میکس یکتا تجهیز آزما

عملکرد بهینه این محصول  امکان تکثیر DNA با غلظت و کیفیت مختلف را فراهم می کند به گونه ای که می توانید در غلظت های بسیار پایین از نمونه الگو (همانند 1ng)، محصول  PCR از الگو هدف را داشته باشید.  در نتیجه میزان بازدهی واکنش پی سی آر  افزایش خواهد یافت. این بهینه سازی پس از بررسی های صورت گرفته در بخش تحقیق و توسعه و انجام آزمایشات لازم در بخش کنترل کیفی این مجموعه ، حاصل شده است.

نتیجه‌گیری

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یکی از ابزارهای ضروری در زیست‌شناسی مولکولی است که امکان انجام تحقیقات ژنتیکی، تشخیص بیماری‌ها، و پیشرفت‌های زیست‌فناوری را فراهم کرده است. با توجه به کاربرد گسترده و پتانسیل بی‌پایان این تکنیک، PCR همچنان به‌عنوان یکی از ستون‌های اصلی تحقیقات علمی باقی مانده است.