عیب یابی در واکنش PCR و Real-Time PCR

عیب یابی در واکنش PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و نسخه پیشرفته آن، Real-Time PCR، ابزارهای اصلی در زیست‌شناسی مولکولی و تشخیص‌های بالینی هستند. با وجود سادگی نسبی در مفهوم، اجرای دقیق آن‌ها نیازمند مهارت عملی، طراحی مناسب، و رعایت اصول کنترل کیفیت است. کاربران تازه‌کار اغلب با مشکلاتی در مراحل آماده‌سازی نمونه، بهینه‌سازی شرایط واکنش، و تفسیر نتایج روبه‌رو می‌شوند.

تکنیک های PCR

چالش‌های رایج در PCR معمولی

1.آلودگی نمونه و محیط کار

• مشکل: مثبت کاذب ناشی از DNA خارجی.
• علت: تماس دست، هوا، تجهیزات آلوده یا محصولات PCR قبلی.
• راهکار:
  • جداسازی کامل فضای pre-PCR و post-PCR
  • استفاده از نوک سمپلر فیلتر‌دار و هود لامینار فلو.
  • شست‌وشوی میز کار

2. کیفیت پایین DNA/RNA

• مشکل: تکثیر ضعیف یا منفی کاذب.
• علت: تجزیه، آلودگی با مهارکننده‌ها، غلظت ناکافی.
• راهکار:
  • استخراج استاندارد با شست‌وشوی کامل.
  • بررسی خلوص با A260/A280 بین 2.0–1.8
  • نگهداری در شرایط سرد پایدار.

3.طراحی پرایمر

• مشکل: محصولات غیراختصاصی یا عدم تکثیر.
• علت: Tm نامتناسب،  GC content نامناسب، ساختارهای ثانویه.
• راهکار: طراحی با نرم‌افزار معتبر و هماهنگی Tm دو پرایمر  ( ≤ 2درجه سانتی گراد اختلاف)

4.بهینه‌سازی شرایط واکنش

مشکل: کاهش بهره‌وری یا تکثیر غیراختصاصی.

• علت: غلظت نامناسب MgCl₂  ،dNTP   یا پرایمر.
• راهکار: استفاده از مسترمیکس آماده یا بهینه‌سازی دستی.

  

خرید مسترمیکس PCR معمولی یکتا تجهیز آزما

 

5.تنظیمات ترموسایکلر

مشکل: دمای Annealing نامناسب یا چرخه‌های بیش از حد.

• راهکار: Gradient PCR برای یافتن دمای بهینه و محدود کردن چرخه‌ها به 35– 30.

6.تفسیر نتایج

• مشکل: اشتباه در شناسایی باندها (مثلاً پرایمر-دایمر).
• راهکار: استفاده از کنترل مثبت، منفی و مارکر اندازه.

سوالات متداول در عیب یابی واکنش PCR

1- بعد از بردن محصول PCR (پی سی آر ) بر روی ژل ، یک باند ضعیف و گاهی هیچ باندی مشاهده نشد. پیشنهاد شما برای حل این مشکل چیست؟

اولین و رایج ترین مشکل پیش آمده در تکنیک PCR عدم مشاهده باند یا مشاهده باند ضعیف بعد از انجام واکنش PCR بر روی  ژل آگارز می باشد. پیشنهاد می شود موارد زیر را مورد بررسی قرار دهید:

خرید رنگ ژل آگاروز | safe stain از یکتا تجهیز آزما

 

• تعداد کم سیکل در PCR

  زمانی که غلظت نمونه زیاد است از سیکل های کمتری استفاده کنید و زمانی که غلظت نمونه کم است از سیکل های بیشتری استفاده کنید.

• زمان extantion کم است

• زمان اتصال پرایمر به هدف (annealing)

  اگر کم باشد پرایمرها زمان کافی برای اتصال به هدف را نخواهند داشت بنابراین حداقل زمان 30 ثانیه را در نظر بگیرید. اگر زمان اتصال پرایمر به هدف (annealing) بسیار زیاد باشد هم پنین نتیجه ای را مشاهده خواهید کرد. قاعده کلی این است که از دمای اتصالی استفاده کنید که 5 درجه سانتیگراد کمتر از Tm پرایمر باشد.

• زمان و دمای denaturation

  اگر مدت زمان باز شدن دو رشته از هم یا دمای باز شدن دو رشته از هم کم باشد دو رشته ای dna به خوبی از هم باز نشده و کارایی تکثیر کاهش می یابد. به همین ترتیب با افزایش زمان دو رشته ای شدن dna ، نمونه تخریب شده و نتایج مطلوب حاصل نمی شود. پیشنهاد می شود برای denaturation اول از دمای 95 و زمان 3 دقیقه و برای denaturation داخل سیکل از دمای 95 به مدت 30 ثانیه استفاده کنید.

• نمونه مورد استفاده

  غلظت و کیفیت نمونه مورد استفاده بسیار مهم است. نمونه ممکن است غلطظت بسیار اندک داشته یا کیفیت پایینی داشته باشد و حاوی مهارکننده های PCR باشد. در صورت احتمال وجود مهارکننده ها پیشنهاد می شود  نمونه موجود را رقیق کنید. بهتر از یک نمونه مطمئن به عنوان کنترل کیفیت جهت بررسی کیفیت نمونه خود استفاده کنید. دقت داشته باشید از مقدار مناسب نمونه برای انجام واکنش استفاده کنید.

• غلظت پرایمر مورد استفاده

  انتخاب غلظت مناسب پرایمر برای انجام واکنش یک مسئله ضروری می باشد. اگر غلظت پرایمر زیاد باشد احتمال اتصال غیراختصاصی افزایش می یابد و چنانچه غلظت پرایمر در واکنش کم باشد اتصال پرایمر به الگو ناکارآمد و با بازدهی پایین خواهد بود.

• مسترمیکس استفاده شده در واکنش PCR

  دقت کنید که مستر میکس مورد استفاده در PCR باید با واکنش طراحی شده تطابق داشته باشد. بنابراین در انتخاب مسترمیکس دقت کنید.

2- در نتایج PCR بر روی ژل باند غیراختصاصی یا پرایمر دایمر مشاهده کردیم ،راهکار شما برای برای عیب یابی در واکنش PCR و این مشکل چیست؟

پیشنهاد ما در وهله اول بررسی پرایمر های مورد استفاده است. بررسی کنید که پرایمرها به درستی طراحی شده باشند و به درستی سنتز شده باشند. جهت حصول نتیجه مناسب بهتر است غلظت مناسب از پرایمر را مورد استفاده قرار دهید. غلظت بالای پرایمر امکان شکل گیری پرایمر دایمر و باند غیراختصاصی را افزایش می دهد. پیشنهاد می شود غلظت پرایمر را کاهش داده و آزمایش را تکرار کنید. غلظت منیزیم به کار برده شده نیز اهمیت دارد. غلظت بالای منیزیم می تواند منجر به شکل گیری باند غیراختصاصی شود.

3- راه حل شما برای مشاهده اسمیر بعد از انجام واکنش PCR پی سی آر بر روی ژل آگارز چیست؟

پیشنهاد می شود موارد زیر را در واکنش مورد بررسی قرار دهید:

• تعداد سیکل های به کار برده شده در واکنش

  اگر تعداد سیکل ها بالا باشد امکان تشکیل باندهای غیراختصاصی و خطا در واکنش می شود. پیشنهاد می شود تعداد سیکل را کاهش دهید و واکنش را تکرار کنید.

• زمان extension 

  اگر زمان extension بسیار طولانی باشد و با طول محصول تناسب نداشته باشد باندهای غیراختصاصی بدین شکل دیده می شود. توصیه می شود از زمان extension متناسب با واکنش خود استفاده کنید.

  اگر زمان extension طولانی و نامتناسب با واکنش و طول محصول مورد نظر می تواند منجر به شکل گیری باندهای غیراختصاصی به شکل اسمیر می شود.

• غلظت نمونه مورد استفاده

  اگر غلظت نمونه خیلی زیاد باشد نتیجه می تواند به صورت اسمیر دیده شود. پیشنهاد می شود غلظت نمونه را کاهش داده و واکنش را تکرار کنید.

• کیفیت نمونه مورد استفاده

اگر نمونه به هر دلیلی کیفیت پایینی داشته باشد و شکسته باشد نتیجه تکثیر به صورت اسمیر دیده خواهد شد

4- پیشنهاد شما برای حل مشکل حضور مهارکننده ها در واکنش پی سی آر چیست؟

مهارکننده های واکنش شامل حضور فنول، EDTA و یا پروتیئن ها در نمونه می باشد. پیشنهاد می شود نمونه را در صورت امکان رقیق کنید تا غلظت مهارکننده ها کاهش یابد. اقدام دیگر در صورت امکان می تواند خالص سازی مجدد نمونه باشد. بنابراین قبل از انجام واکنش حتما کیفیت DNA مورد استفاده را مورد بررسی قرار دهید.

عیب یابی در Real-Time PCR

در تکنیک Real-Time PCR به دلیل حساسیت بالا، خطاهای کوچک در طراحی، آماده‌سازی یا اجرای آزمایش می‌تواند نتایج را دچار اختلال کند. بنابراین شناسایی مشکلات رایج و عیب یابی در Real-Time PCR و به‌کارگیری راهکارهای مناسب، بخش مهمی از کار با این روش است.

چالش‌های رایج در Real-Time PCR

1. مشکل در رنگ‌ها یا پروب‌ها

•  SYBR Green : اتصال به هر محصول دو رشته‌ای، حتی محصولات غیراختصاصی یا پرایمر-دایمر.
  

  مسترمیکس سایبرگرین

خرید مسترمیکس سایبرگرین از یکتا تجهیز آزما

 

• پروب‌ها: (TaqMan, Molecular Beacon) طراحی ضعیف یا تخریب پروب باعث افت سیگنال می‌شود.
• راهکار: بررسی اختصاصیت با منحنی ذوب (Melt Curve) در SYBR و طراحی دقیق پروب در روش‌های پروبی.

2. بهره‌وری واکنش (Efficiency)

• مشکل: بهره‌وری کمتر از %90 یا بیشتر از %110 باعث خطای کمی‌سازی می‌شود.
• راهکار: بهینه‌سازی غلظت پرایمر، استفاده از DNA استاندارد تازه و حذف مهارکننده‌ها.

3. Threshold Setting

• مشکل: خط آستانه اشتباه، تغییر Ct و تفسیر غلط.
• راهکار: انتخاب آستانه در ناحیه نمایی منحنی تکثیر.

4. کنترل‌های داخلی (Internal Control)

• مشکل: عدم شناسایی منفی کاذب در غیاب کنترل داخلی.
• راهکار: استفاده از ژن مرجع یا RNA/DNA غیرهدف به‌عنوان کنترل.

5. پلات استاندارد (Standard Curve)

• مشکل: طراحی ضعیف یا استانداردهای ناپایدار.
• راهکار: تهیه سری رقت تازه و ذخیره در شرایط مناسب.

6. کالیبراسیون دستگاه

• مشکل: اختلاف داده‌ها بین چراغ‌ها یا بلوک‌های حرارتی.
• راهکار: کالیبراسیون دوره‌ای طبق توصیه سازنده.

با رعایت این اصول و بررسی دقیق منحنی‌ها، کنترل‌ها و شرایط دستگاه، می‌توان خطاهای رایج Real-Time PCR را به حداقل رساند و به نتایج قابل اعتماد دست یافت.