فرآیند PCR
یکی از روش های رایج و متعارف آزمایشگاهی ، فرآیند PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز است که بر گرفته از نام Polymerase Chain Reaction می باشد که روشی مبتنی بر تکثیر قطعه ی مشخصی از DNA است. یکی از مزیت های این روش عدم محدودیت در انتخاب قطعه ی هدف است و قطعه ی هدف می تواند همه یا بخشی از ژن‌های رمزکننده پروتئین ، RNA یا قسمتی از یک بیومارکر یا نشانگر زیستی باشد که در احراز هویت در پزشکی قانونی کاربرد دارد .
بر همین اساس هدف از فرآیند PCR ، دستیابی به تعداد انبوه کپی از ناحیه ی هدف می باشد .گام بعدی این فرآیند ، به کار گیری این کپی ها جهت تحقیق ، پژوهش ، تجزیه و تحلیل خصوصیات و یا فازها متفاوت در کلونینگ و همچنین در تعیین توالی ، انتقال به ژل الکتروفورز و درج در پلاسمید می باشد.
به همین علت تکنیک PCR در شاخه های علمی زیست فناوری مانند زیست شناسی مولکولی ، تشخیص پزشکی و نیز در گروه هایی از اکولوژی بسیار حائز اهمیت است .
ترکیبات اصلی در مسترمیکس PCR
- آنزیم Taq پلیمراز ( Taq DNA polymerase)
- بافر PCR
- نوکلئوتیدها ( dNTP)
- MgCl2
- رنگ آبی بروموفنول
آنزیم Taq پلیمراز ( Taq DNA polymerase)
مبنای مسترمیکس PCR و نیز اساس کار واکنش PCR ، آنزیم Taq پلیمراز می باشد .این آنزیم از باکتری ترموس آکواتیکوس استخراج می شود . این آنزیم با توجه به شرایط زندگی باکتری ترموس آکوآتیکوس که در دریچه های عمیق اقیانوس ها می باشد ، مقاوت بالایی نسبت به گرما دارند و پایدار هستند. فعالیت این آنزیم تا دمای 70 درجه سانتی گراد پایدار است . در اینجا توجه شما را به ویژگی های این آنزیم جلب می کنیم :
اولین مورد heat stability و یا پایداری گرمایی آنزیم Taq پلیمراز می باشد که در دماهای بالاتر از محیط برقرار است . از دومین مزیت این آنزیم Processivity و یا قدرت پردازش آن است که به حفظ پیوند به سوسترا تا پایان واکنش اطلاق می گردد و سومین ویژگی این آنزیم fidelity و یا عملکرد صحیح آن است که همان پیوند صحیح مولکول در جای مناسب خود می باشد و این ویژگی در پلیمراز ها باعث می شود هر مولکول مکمل در مقابل نوکلئوتید صحیح قرار بگیرد.
نقش پرایمر ها در واکنش PCR
همانطور که آنزیم Taq پلیمراز اساس کار واکنش PCR است ، پرایمر ها هم نقش بسزایی دارند و آنزیم Taq پلیمراز فقط با وجود پرایمر توانایی سنتز رشته جدید را دارد . پرایمرها با ایجاد سر آزاد oH در مجاورت آنزیم باعث ایجاد یک نقطه شروع برای آن می شود .به طور کلی در هر واکنش PCR دو پرایمر برای اتصال به دو رشته ی DNA لازم است .
شرکت یکتا تجهیز آزما با تولید دو مسترمیکس PCR به نیاز کاربران پاسخ داده است. مسترمیکس سوپر PCR که شامل آنزیم Taqplus و خاصیت proof-reading است که باعث قوی تر شدن محصول و حساسیت بالای آن شده است . محصول دیگر مسترمیکس PCR با آنزیم Taq پلیمراز است که شامل همه ی جزییات لازم در واکنش PCR می باشد .
مراحل واکنش PCR
مراحل اصلی در یک واکنش PCR در ابتدا شامل دناتوراسیون (Denaturation) است که در دمای 96 درجه سانتی گراد انجام می گیرد که دو رشته ی الگو از هم باز می شوند . سپس مرحله ی اتصال در دمای بین 55 تا 65 درجه سانتی گراد انجام می گیرد که پرایمر ها به توالی های مکمل خود متصل می شوند . در مرحله ی طویل سازی که در دمای 72 درجه سانتی گراد انجام می شود و آنزیم taq پلیمراز فعال و ساخت رشته جدید صورت می گیرد .
کاربرد و استفاده از PCR
مواردی که در ذیل به آن ها اشاره شده است ، از مرسوم ترین و رایج ترین کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) به شمار می روند :
- تحقیق و پژوهش درباره ی عامل ژن‌های تاثیرگذار در یک بیماری
- تحقیق و پژوهش علل بروز بیماری های عفونی
- کمک به تشخیص پزشکی دقیق
- تکثیر یک قطعه از رونوشت ژن ( Reverse Transcriptase PCR )
- جهت احراز هویت در پزشکی قانونی
- مطالعه ی درست تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن ( Real-Time PCR )
- مطالعه ی تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن در مقایسه با ژن دیگر ( Semi-quantitative PCR )
بهینه سازی مسترمیکس PCR
طبق آخرین نسخه ی بهینه سازی شده مستر میکس یکتا تجهیز آزما
عملکرد بهینه این محصول امکان تکثیر DNA با غلظت و کیفیت مختلف را فراهم می کند به گونه ای که می توانید در غلظت های بسیار پایین از نمونه الگو (همانند 1ng)، محصول PCR از الگو هدف را داشته باشید. در نتیجه میزان بازدهی واکنش پی سی آر افزایش خواهد یافت. این بهینه سازی پس از بررسی های صورت گرفته در بخش تحقیق و توسعه و انجام آزمایشات لازم در بخش کنترل کیفی این مجموعه ، حاصل شده است. (شکل رو به رو )
