روش‌ های جدید استخراج DNA و RNA آزاد سلولی

DNA  و RNA آزاد سلولی (cell-free DNA/RNA) مولکول‌ هایی هستند که بدون نیاز به استخراج از سلول‌ های زنده، در مایعات بدن مانند خون، بزاق و ادرار وجود دارند. این نوکلئیک‌ اسیدها اطلاعات ارزشمندی در زمینه تشخیص زودهنگام سرطان، بیماری‌های ژنتیکی و عفونت‌ های ویروسی فراهم می‌کنند. توسعه روش‌های استخراج نسل جدید با هدف افزایش حساسیت، دقت و بازدهی، نقشی کلیدی در موفقیت بیوپسی مایع (liquid biopsy) دارد. در این مقاله به معرفی اصول و فناوری‌ های نوین در استخراج cfDNA/cfRNA پرداخته و کاربردهای بالینی آن بررسی می‌گردد.

DNA و RNA آزاد سلولی (cfDNA و cfRNA) به‌صورت طبیعی از سلول‌های در حال مرگ یا آپوپتوزی به جریان خون رها می‌شوند. این مولکول‌ها به‌عنوان بیومارکرهای غیرتهاجمی برای تشخیص و پایش بیماری‌ها مطرح هستند. با این حال، غلظت پایین، اندازه کوتاه و حساسیت بالای cfNA به تخریب، استخراج آن‌ها را به چالشی جدی تبدیل کرده است.

روش‌ های جدید استخراج DNA و RNA آزاد سلولی

گامی به‌سوی کاربردهای فوق‌حساس بیوپسی مایع

با ظهور فناوری‌های نسل جدید، استخراج این مولکول‌ها با دقت، بازدهی و سرعت بالاتر ممکن شده است. در این مقاله روش‌های نوین استخراج، چالش‌ها و کاربردهای آن‌ها مرور می‌شود.

DNA و RNA آزاد سلولی (که معمولاً بهشون cfDNA و cfRNA گفته می‌شه) با DNA و RNA داخل سلولی تفاوت‌هایی دارند:

• محل وجود: DNA و RNA داخل سلولی، داخل هسته یا سیتوپلاسم سلول‌ها قرار دارند، ولی DNA و RNA آزاد سلولی در مایعات بدن مثل خون، ادرار و مایع مغزی-نخاعی آزاد هستند.
• ساختار و اندازه: cfDNA و cfRNA معمولاً قطعات کوتاه‌تر و پراکنده‌تری از مولکول‌های بزرگ DNA و RNA داخل سلول هستند.
• پایداری: DNA و RNA داخل سلولی نسبت به cfDNA و cfRNA پایدارتر هستند، چون cfDNA و cfRNA به سرعت در محیط بیرون سلول تخریب می‌شوند مگر اینکه شرایط نگهداری مناسبی داشته باشند.
• کاربرد: cfDNA و cfRNA بیشتر به عنوان شاخص‌های زیستی غیرتهاجمی برای تشخیص بیماری‌ها، ردیابی سرطان یا پیگیری درمان استفاده می‌شوند، در حالی که DNA و RNA داخل سلولی معمولاً برای بررسی ژنتیکی و بیان ژن‌های سلول کاربرد دارند.

پس می‌توان گفت که DNA و RNA آزاد سلولی، فرم خاص و قابل دسترسی‌تری از مولکول‌های ژنتیکی هستند که به علت محل و شرایط وجودشان، کاربردهای تشخیصی ویژه‌ای پیدا کرده‌اند.

1. ویژگی‌های cfDNA و cfRNA

• اندازه کوتاه‌تر از DNA ژنومی (150 تا 200 جفت باز):
  قطعات cfDNA و cfRNA نسبت به DNA داخل سلولی بسیار کوتاه‌تر بوده و معمولاً طول آنها بین ۱۵۰ تا ۲۰۰ جفت باز است. این اندازه کوچک، انتقال و شناسایی آنها را در مایعات بدن آسان‌تر می‌کند.
• غلظت کم در پلاسما (10–100 نانوگرم در میلی‌لیتر):
  غلظت cfDNA و cfRNA در پلاسمای خون پایین است و معمولاً در محدوده ۱۰ تا ۱۰۰ نانوگرم در هر میلی‌لیتر قرار دارد. بنابراین، استخراج و آنالیز آنها نیازمند روش‌های حساس و دقیق می‌باشد.
• ناپایداری بالا در صورت عدم نگهداری صحیح:
  این مولکول‌ها در صورت عدم رعایت شرایط نگهداری مناسب، به سرعت تخریب می‌شوند. حفظ نمونه‌ها در شرایط استاندارد، برای نگهداری کیفیت آنها ضروری است.
• حضور در مایعات بدن بدون نیاز به نمونه‌برداری تهاجمی:

cfDNA و cfRNA در مایعات بدن مانند خون و ادرار یافت می‌شوند و برای جمع‌آوری آنها نیازی به انجام نمونه‌برداری تهاجمی نیست. این ویژگی، کاربرد آنها را در تشخیص‌های غیرتهاجمی بسیار ارزشمند می‌سازد.

2. انواع روش های رایج استخراج DNA/RNA

• روش فنول-کلروفرم: روش قدیمی، خطرناک، کم بازده برای cfNA
• روش ستون‌های سیلیکا: رایج‌ترین روش؛ استفاده از جاذب‌هایی که DNA/RNA به آن‌ها متصل می‌شوند.شرکت یکتا تجهیز آما وارد کننده و توزیع کننده انواع کیت استخراج ستونی فیورژن در سراسر ایران می باشد.
• کیت‌های مبتنی بر لیس و الوت: مانند QIAamp یا Zymo – عملکرد نسبتاً مناسب اما بهینه نشده برای cfNA

3. روش‌ های جدید استخراج DNA و RNA

 3.1.  نانوذرات مغناطیسی (Magnetic Beads)

• قابلیت انتخاب‌پذیری بالا برای قطعات کوتاه cfDNA
• مناسب برای اتوماسیون
• کاهش زمان و افزایش بازدهی
• مثال: MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit

3.2. میکروسیال‌ها و چیپ‌های میکروسیالی (Microfluidics)

• استفاده از سیستم‌های lab-on-a-chip
• کاهش مصرف مواد شیمیایی و نمونه
• قابلیت ادغام با qPCR یا NGS

3.3.  استخراج انتخابی با پروب‌های مکمل (Capture-based extraction)

• استفاده از اولیگونوکلئوتیدهای مکمل توالی‌های خاص
• مناسب برای استخراج cfRNA یا miRNA خاص
• حساسیت بالا برای تشخیص جهش‌های نادر

4. کاربرد های بالینی cfDNA و cfRNA

4.1.  سرطان‌شناسی

• شناسایی جهش‌های توموری در cfDNA
• بررسی متیلاسیون cfDNA به‌عنوان نشانگر سرطان
• ارزیابی پاسخ به درمان و عود بیماری

4.2. غربالگری پیش از تولد (NIPT)

• تشخیص ناهنجاری‌های ژنتیکی جنینی از cfDNA مادر
• بدون خطر برای جنین

4.3. بیماری‌های عفونی

• شناسایی RNA ویروسی مانند HIV، HCV یا SARS-CoV-2 از پلاسما
• کاربرد در شناسایی عفونت‌های زودرس

4.4.  پایش پیوند عضو

• بررسی cfDNA گیرنده به‌عنوان نشانگر رد پیوند

 آینده استخراج cfNA

• ادغام با روش‌های هوش مصنوعی برای تحلیل داده
• تولید کیت‌های Point-of-Care
• افزایش حساسیت به حد یک مولکول (digital PCR)

نتیجه‌گیری

cfDNA و cfRNA ابزارهایی نوظهور و بسیار ارزشمند در پزشکی دقیق و تشخیص غیرتهاجمی هستند. استخراج دقیق و سریع این مولکول‌ها با فناوری‌های نسل جدید، نه‌تنها تشخیص زودهنگام بیماری‌ها را ممکن می‌سازد، بلکه آینده بیوپسی مایع را متحول خواهد کرد. سرمایه‌گذاری در توسعه روش‌های بهینه و بومی‌سازی کیت‌های استخراج cfNA، می‌تواند گامی مؤثر در ارتقاء توان داخلی کشور در حوزه تشخیص مولکولی باشد.