سنتز cDNA چیست؟ مراحل نسخه‌برداری معکوس

سنتز cDNA یا نسخه‌برداری معکوس چیست؟

سنتز cDNA (یا DNA مکمل) فرآیندی کلیدی در زیست‌فناوری و زیست‌شناسی مولکولی است که طی آن یک رشته DNA از روی RNA ساخته می‌شود. این فرآیند با نام نسخه‌برداری معکوس (Reverse Transcription) شناخته می‌شود و در بسیاری از کاربردهای آزمایشگاهی مانند تحلیل بیان ژن، RT-PCR، و تشخیص ویروسی نقش حیاتی دارد.

در این مقاله، علاوه بر بررسی مراحل سنتز cDNA و نقش آنزیم ریورس ترانسکریپتاز، با محتویات کیت سنتز cDNA یکتا تجهیز آزما نیز آشنا می‌شویم.

cDNA چیست؟

cDNA مخفف Complementary DNA به معنی DNA مکمل است. این مولکول از روی RNA پیام‌رسان (mRNA) ساخته می‌شود و تنها شامل اگزون‌ها یا بخش‌های کدکننده ژن است؛ بنابراین، برخلاف DNA ژنومی که شامل اینترون و اگزون است، cDNA فقط نماینده‌ی ژن‌های فعال در سلول است. این آنزیم تحت عنوان های  آنزیم وارونویس ، رونوشت بردار معکوس ، ترانس کریپتاز معکوس و نیز آنزیم RT و یا آنزیم  Reverse transcriptase خوانده می شود

آنزیم RT

این آنزیم که در کیت سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفته است ، از نوع H Minus ( H- ) بوده و از ویروس  Moloney Murine Leukemia   و یا به اختصار MMLV استخراج شده است . از جمله امتیازات این آنزیم توانایی تحمل حرارت می باشد که نسبت به آنزیم های دیگر بالاتر است . فعالیت آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ( MMLV ) که از محصولات بسیار ارزشمند شرکت یکتاتجهیزآزما می باشد ،  در 50 درجه سانتی گراد ، به طور کامل پایدار است و در دمای 55 درجه سانتی گراد تا 80 درصد فعالیت آن حفظ می شود.

این آنزیم ها  می توانند از روی  مولکول RNA ، سنتز  DNA را انجام دهند . DNA مکمل یا  cDNA  به رشته ای از مولکول DNA گفته می شود که به واسطه ی  فعالیت های آنزیم MMLV ( رونوشت بردار معکوس ) از روی رشته ی RNA ساخته شده است . از جمله کاربردهای cDNA می توان به کلون کردن ژن در سلول‌ها ، ساخت کتابخانه cDNA و نیز به‌ عنوان پروب در آنالیز ژن‌ها اشاره کرد . البته از برجسته ترین کاربرد آن  بررسی سطح بیان ژن ها به صورت کمی می باشد .

آنزیم های RT و یا رونوشت بردار معکوس انواع مختلفی دارند که معمولا منشا ویروسی دارند و انواع مختلف آنها در بازار بیولوژی مولکولی بر اساس نیاز کاربر موجود می باشد.

یک سری از RNA ویروس های تک رشته ای که سبب بروز عفونت در سلول های جانوری می شوند ، دارای مولکول DNA پلیمراز وابسته به RNA  تحت نام ترانس کریپتاز معکوس ( Reverse Transcriptase) در ذره ی ویروسی هستند .

زمانی که عفونت در داخل سلول جانوری رخ می دهد ، ژنوم RNA ویروسی با وجود ده هزار نوکلئوتید با همراهی آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (Rreverse transcriptase ) و نیز یک tRNA به عنوان حمل کننده ی آنزیم ، از سلول میزبان خود به یک سلول میزبان جدید منتقل می گردد.

مراحل سنتز cDNA چگونه است؟

1. استخراج RNA

ابتدا RNA کل یا mRNA خاص از سلول یا بافت مورد نظر استخراج می‌شود. کیفیت و خلوص RNA برای نتیجه موفقیت‌آمیز بسیار مهم است.

2. طراحی پرایمر

برای شروع واکنش نسخه‌برداری معکوس، از یکی از این پرایمرها استفاده می‌شود:

• Oligo(dT): به دم پلی‌آ موجود در انتهای mRNA متصل می‌شود.

• Random Hexamer: برای رونویسی از همه‌ی انواع RNA مناسب است.

• Gene-specific Primer: برای هدف قرار دادن یک ژن خاص.

3. استفاده از ریورس ترانسکریپتاز

این آنزیم، RNA را به DNA مکمل تبدیل می‌کند. آنزیم باید دارای عملکرد پایدار، مقاوم در برابر حرارت و فاقد فعالیت RNase باشد.

4. حذف RNA و سنتز رشته دوم (در صورت نیاز)

در برخی کاربردها (مانند کلونینگ)، از آنزیم RNase H و DNA پلیمراز برای حذف RNA اولیه و ساخت رشته دوم DNA استفاده می‌شود.

تفاوت بین DNA ژنومی و cDNA چیست؟

کاربردهای سنتز cDNA

✅ تحلیل بیان ژن

با سنتز cDNA از RNA استخراج‌شده، می‌توان با استفاده از تکنیک RT-qPCR میزان بیان ژن‌های خاص را اندازه‌گیری کرد.

✅ تشخیص ویروس‌ها (مانند کرونا یا HIV)

ویروس‌های RNA دار ابتدا به cDNA تبدیل می‌شوند تا بتوان از طریق PCR آن‌ها را تشخیص داد.

✅ کلون‌سازی ژن

از آنجا که cDNA اینترون ندارد، برای کلون کردن ژن‌های یوکاریوتی در باکتری‌ ها بسیار مناسب است.

✅ ساخت کتابخانه‌های cDNA

برای بررسی بیان ژن‌ها در شرایط مختلف یا در سلول‌های خاص، از کتابخانه‌های cDNA استفاده می‌شود.

مزایای استفاده از cDNA

• پایداری بیشتر نسبت به RNA

• امکان انجام PCR و کلونینگ

• مناسب برای بررسی دقیق بیان ژن

• حذف اینترون‌ها و تمرکز بر توالی‌های کدکننده

معرفی کیت سنتز cDNA یکتا تجهیز آزما

✅ کیت سنتز cDNA یکتا تجهیز یک محصول با کیفیت و قیمت رقابتی است که برای استفاده در آزمایشگاه‌ های تحقیقاتی و تشخیصی طراحی شده است.

محتویات کیت به‌طور معمول شامل:

🔬 حجم واکنش: قابل تنظیم برای 20 یا 50 واکنش
🧊 نگهداری: در دمای -20 درجه سانتی‌گراد

چرا کیت یکتا تجهیز را انتخاب کنیم؟

• قیمت مقرون‌به‌صرفه نسبت به نمونه‌های دیگر

• پشتیبانی فنی و ارسال سریع

• مناسب برای RT-PCR و qRT-PCR

جمع‌بندی

سنتز cDNA فرآیندی اساسی در مطالعات مولکولی است که با کمک آن می‌توان RNA را به DNA پایدار و قابل‌تحلیل تبدیل کرد. استفاده از کیت‌هایی مانند کیت سنتز cDNA یکتا تجهیز آزما، امکان انجام تحقیقات دقیق و مقرون‌به‌صرفه را فراهم می‌سازد.

🔑 کلمات کلیدی سئو:

سنتز cDNA چیست، ریورس ترانسکریپتاز، نسخه‌برداری معکوس، کیت سنتز cDNA یکتا تجهیز، RT-PCR، mRNA، کلونینگ ژن، RNA مکمل، زیست‌فناوری مولکولی، کیت ایرانی cDNA، پرایمر Oligo(dT)، کاربرد cDNA

همان طور که در بالا به اجزای کیت اشاره کردیم ، یک واکنش سنتز cDNA دارای موارد زیر می باشد:

• آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ( آنزیم  RT یا آنزیم وارونویس ) که منشا ویروسی دارد مانند MMLV ، HIV-1 و AMV که در کیت تولیدی یکتا تجهیز آزما از نوع MMLV (H-) استفاده شده است .
• بافر مخصوص  آنزیم ترانس کریپتاز معکوس که کاملا بهینه با کیت سنتز cDNA  و با غلظت 5X تولید شده است .
• پرایمر های مخصوص واکنش سنتز cDNA که به طور معمول از دو نوع پرایمر Oligo dT و Random Hexamer استفاده می شود.  گاهی اوقات کاربر بر حسب نیاز ، تقاضای پرایمر اختصاصی جهت mRNA هدف می نماید.
• محدود کننده RNA که با غلظت 40 یونیت در ماکرولیتر برای این کیت در نظر گرفته شده است و از تولیدات شرکت یکتا تجهیز آزما می باشد .
• چهار نوع نوکلئوتید ( dNTP ) با غلظت 10mM

آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (  آنزیم MMLV ) با غلظت 200 یونیت در ماکرولیتر و در حجم 10,000 یونیتی برای این کیت در نظر گرفته است و این کیت  در بسته بندی 50 تستی ارائه می گردد . کاربران عزیز می توانند برای بررسی و مشاهده ی دستورالعمل به وبسایت شرکت یکتا تجهیز آزما مراجعه کرده و در قسمت محصولات و زیر مجموعه ی RT-PCR ، به مشخصات محصول و پروتکل آپلود شده دسترسی پیدا کنند .