استخراج RNA به روش دستی | استخراج RNA با ترایزول

ارسال توسط

در تاریخ

استخراج دستی RNA با بهره‌گیری از فنل-کلروفرم است که اغلب با معرف‌هایی مانند YTZOLو TRIzol انجام می‌شود. این تکنیک شامل مراحل کلیدی‌ای مانند لیز سلولی، جداسازی فازهای مختلف به کمک فنل-کلروفرم، و در نهایت، رسوب‌گذاری RNA با ایزوپروپانول است.

استفاده از این روش امکان دستیابی به RNA با کیفیت بالا را برای مطالعات مولکولی و ژنتیکی فراهم می‌سازد.

محلول ترایزول یک محلول شیمیایی است که در استخراج DNA ، RNA و پروتئین ها از سلول ها استفاده می شود.

TRIZol بر روی مقادیر کمی از بافت (50-100 میلی گرم) و سلول (5×10⁶) نیز به خوبی عمل می کند.همچنین قابل استفاده برای نمونه هایی با منشاء انسانی، حیوانی، گیاهی یا باکتریایی می باشد. این محلول به نور حساس است و اغلب در یک ظرف شیشه ای با رنگ تیره نگهداری می شود. همچنین باید ترایزول را در دمای پایین تر از دمای اتاق نگهداری کرد.

محلول ترایزول بوی فنل بسیار قوی میدهد و با حفظ یکپارچگی RNA در حین همگن سازی بافت کار می کند ، در عین حال منجر به اختلال و تجزیه سلول ها و اجزای سلولی می شود.

این محصول حاوی گوانیدین تیوسیانات و فنول است. این محلول با نام های تجاری متفاوت بفروش میرسد.

ترایزول همان وایتیزول با برند تجاری یکتا تجهیز است.
برای قیمت و خرید وایتیزول (ترایزول) وارد صقحه فروشگاه یکتاتجهیز آزما شده و یا بر روی لینک همین متن کلیک کنید

فهرست مطالب

استخراج RNA به روش دستی

استخراج RNA یک تکنیک پیش نیاز برای مطالعات بیان ژن، تجزیه و تحلیل علت شناسی و پیشرفت بیماری، اثرات درمانی، و همچنین طراحی روش های تشخیصی می باشد.

این روش فرآیندی است که طی آن RNA کل موجود در یک نمونه هموژنیزه شده سلولی جدا و تصفیه می‌شود و درصنعت بیوتکنولوژی، مهندسی ژنتیک و… کاربرد ویژه‌ای دارد و یکی از مقدمات اولیه ی ضروری در پروسه های PCR و RT-PCR می‌باشد.

اگرچه بسیاری از کیت های استخراج RNA تجاری شده اند، اما این کیت ها گران هستند و در برخی کشورها قابل دسترسی نیستند. بسیاری از مطالعات نشان داده اند که TRIZol یک ماده قابل استفاده برای استخراج RNA است از نمونه های مختلف بیولوژیکی است. TRIZol یک معرف کامل و آماده برای جداسازی RNA کل با کیفیت بالا یا جداسازی همزمان RNA، DNA و پروتئین از انواع نمونه های بیولوژیکی است.

استخراج RNA با این محلول مدتها است که توسط کاربران انجام میشود. محلول ترایزول(YTzol pure RNA) مانع تخریب نمونه ها در طول مراحل استخراج میشود .

به عبارت دیگر ، محلول ترایزول (YTzol pure RNA) کیفیت و کمیت RNA را حفظ می کند و باعث می شود تا مزیت آن به عنوان یک وسیله ذخیره سازی و همچنین یک محلول استخراج دو برابر شود.

با این حال ، در روش هایی مانند استفاده از کلروفرم ، زمان طولانی سانتریفیوژ و نیاز به مراحل رسوب گذاری در طی فرآیند جداسازی موانع عمده ای وجود دارد. این روش مستلزم تخصص و مهارت فنی مورد نیاز است تا از بازیابی کافی RNA از نمونه ها اطمینان حاصل شود.

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای استخراج RNA به روش دستی :

TRIzol reagent
سلول یا بافت (در حدود 5–100 میلی‌گرم بافت یا 10⁶ سلول)
کلروفرم (chloroform)
ایزوپروپانول (isopropanol)
اتانول 75٪ (در DEPC-treated water)
سانتریفیوژ
میکروتیوپ RNase-free
سمپلر و نوک‌های RNase-free
بن‌ماری یا یخ خشک (در صورت استفاده از بافت تازه یا فریز شده)

مراحل استخراج RNA با ترایزول:

1. لیز سلول‌ها/بافت‌ها

مقدار مناسبی از نمونه (مثلاً 10⁶ سلول یا 50–100 میلی‌گرم بافت) را به میکروتیوپ RNase-free منتقل کنید.
به آن 1 میلی‌لیتر TRIzol اضافه کنید (برای 10⁶ سلول یا 100 میلی‌گرم بافت).
با پیپت یا هموژنیزر نمونه را کاملاً لیز کنید.
5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.

2. جداسازی فازها (فاز آبی حاوی RNA)

200 میکرولیتر کلروفرم (به ازای هر 1 میلی‌لیتر TRIzol) اضافه کنید.
خوب ورتکس کنید (15 ثانیه).
2–3 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
سانتریفیوژ 12,000 × g به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد.
3 فاز تشکیل می‌شود:
- فاز بالایی: شفاف (RNA)
- فاز میانی: سفید (DNA)
- فاز زیرین: قرمز (پروتئین‌ها و لیپیدها)
فاز بالایی (حدود 500–600 µl) را به میکروتیوپ جدید منتقل کنید، بدون تماس با فاز میانی.

3. رسوب RNA

به فاز آبی به دست آمده، حجم مساوی ایزوپروپانول اضافه کنید.
10 دقیقه در دمای اتاق یا 20 دقیقه در -20 درجه سانتی‌گراد انکوبه شود.
سانتریفیوژ 12,000 × g به مدت 10 دقیقه در 4 درجه.
رسوب RNA به صورت پلت سفید در ته لوله ظاهر می‌شود.

4. شست‌وشو

سوپرناتانت را بردارید.
1 میلی‌لیتر اتانول 75٪ (سرد) به پلت اضافه کنید.
ورتکس ملایم یا تکان دهید.
سانتریفیوژ 7,500 × g به مدت 5 دقیقه در 4 درجه.
اتانول را دور بریزید و پلت را به آرامی هواخشک کنید (حدود 5–10 دقیقه). نباید کاملاً خشک شود چون حل شدن RNA سخت می‌شود.

5. حل کردن RNA

پلت را در 20–50 µl آب RNase-free یا TE buffer حل کنید.
در دمای 55–60 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید.

بررسی کیفیت و کمیت RNA:

با استفاده از نانودرآپ یا اسپکتروفتومتر (A260/A280).
بررسی کیفیت با الکتروفورز ژل آگارز (برای مشاهده نوارهای 18S و 28S).

علت استفاده از یخ در استخراج rna

به طور کلی در فرایند استخراج RNA، استفاده از یخ یا حفظ نمونه‌ها در دمای پایین نقش بسیار مهمی دارد. دمای پایین باعث مهار فعالیت آنزیم‌های RNase می‌شود که به‌طور طبیعی در سلول‌ها وجود دارند و می‌توانند RNA را به سرعت تجزیه کنند. از آن‌جایی که RNA نسبت به تخریب بسیار حساس است، خنک نگه‌داشتن نمونه‌ها در طول مراحل مختلف استخراج، به حفظ یکپارچگی و کیفیت RNA کمک می‌کند. در واقع، یخ به عنوان یک عامل بازدارنده تخریب، شرایط پایدار و ایمنی را برای استخراج موفق RNA فراهم می‌سازد.

📝 نکات مهم:

همه مراحل باید با تجهیزات RNase-free انجام شود.
استفاده از دستکش و رعایت شرایط استریل ضروری است.
RNA استخراج‌شده را در 80º- نگهداری کنید.

محلول ترایزول YTzol pure RNA (وایتیزول) چیست؟

محلول ترایزول یک محلول شیمیایی است که در استخراج DNA ، RNA و پروتئین ها از سلول ها استفاده می شود.

. TRIZol بر روی مقادیر کمی از بافت (50-100 میلی گرم) و سلول (5×10⁶) نیز به خوبی عمل می کند.همچنین قابل استفاده برای نمونه هایی با منشاء انسانی، حیوانی، گیاهی یا باکتریایی می باشد. این محلول به نور حساس است و اغلب در یک ظرف شیشه ای با رنگ تیره نگهداری می شود. همچنین باید ترایزول را در دمای پایین تر از دمای اتاق نگهداری کرد.

این محصول حاوی گوانیدین تیوسیانات و فنول است. این محلول با نام های تجاری متفاوت بفروش میرسد.

عوارض ترایزول (وایتیزول)

در هنگام استفاده از این محصول (به دلیل فنول-کلروفرم ) باید احتیاط کرد.

قرار گرفتن در معرض محلول ترایزول (TRIzol) می تواند خطر جدی برای سلامتی ایجاد کند و منجر به سوختگی شدید شیمیایی و زخم دائمی شود. هنگام استفاده از محلول ترایزول روپوش آزمایشگاهی ، دستکش و پیش بند پلاستیکی توصیه می شود.

ویژگی های محلول ترایزول

محلول ترایزول یک معرف مبتنی بر اسید گانیدینیوم فنل است که برای استخراج RNA و همچنین DNA و پروتئین ارائه شده است. pH پایین (اسیدی) ترایزول جداسازی RNA از DNA و پروتئین رامهار می کند ، در حالی که pH بالای آن باعث جدا شدن RNA و DNA در کنار هم می شود. گوانیدین تیوسیانات به عنوان یک عامل مخرب در تغییر ساختار پروتئین ها وارد عمل میشود و فنول برای استخراج اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها نیز استفاده می شود. معرف TRIzol یکپارچگی RNA را به دلیل مهار بسیار موثر فعالیت آنزیم RNase حفظ می کند.

نقش ترایزول در استخراج RNA

محلول Trizolیک محلول مونوفازی است که به طور همزمان مواد بیولوژیکی را حل می کند و پروتئین را دفع می کند. پس از حل شدن ، افزودن کلروفرم باعث جداسازی فاز می شود جایی که پروتئین به فاز آلی استخراج می شود ، DNA در رابط حل می شود و RNA در محلول آبی باقی می ماند. بنابراین ، RNA ، DNA و پروتئین را می توان از یک نمونه واحد خالص کرد. استخراج با روش دستی YTzol pure RNA همچنین یک روش مؤثر برای جداسازی RNA های کوچک ، مانند میکرو RNA ها ، RNA های مرتبط با پیوی یا RNA های مداخله گر کوچک و درون زا است.