استخراج RNA به روش ستونی

با توجه به اهمیت بررسی ژنوم انواع بیماری ها و روش های متفاوتی که برای آن ها در نظر گرفته شده است ، اما همچنان یکی از روش های مورد استقبال که پایه و اساس بررسی ژنتیک جانداران می باشد و نیز در مقایسه با دیگر روش ها  ساده و کم هزینه محسوب می شود  همان کیت استخراج RNA به روش ستونی بوده که در اکثر آزمایشگاه ها و موسسات تحقیقی دنیا مورد توجه قرار گرفته و از اهمیت ویژه ای برخوردار است و شرکت های تجاری در دنیا اقدام به تولید و توزیع این نوع کیت ها کرده اند.

درشت مولکول های RNA با وزن مولکولی بالا ، نقش بسیار مهمی تحت عنوان حامل کد های ژنتیکی در برخی از بیماری های ویروسی دارند. این مولکول ها به دلیل واکنش پذیری بالا و نیز مستعد هیدرولیز شدن ، از نظر ساختاری نسبت به DNA پایداری کمتری دارند .

شرکت یکتا تجهیز آزما بعنوان نماینده انحصاری کمپانی Favorgen تایوان، اقدام به توزیع کیت استخراج RNA از نمونه های مختلف کرده است . این کیت دارای یک دستورالعمل استاندارد و چندین دستورالعمل بهینه شده برای نمونه های خاص و متفاوت می باشد .

استخراج RNA به روش ستونی یکی از روش‌های رایج و کارآمد برای جداسازی RNA از نمونه‌های بیولوژیکی است. این روش بر پایه استفاده از ستون‌های سیلیکا طراحی شده است که امکان جداسازی سریع و با کیفیت RNA را فراهم می‌آورد. در ادامه، مراحل اصلی این فرآیند را به تفصیل شرح می‌دهیم:

استخراج RNA به روش ستونی

کیت استخراج RNA به روش ستونی  یه روش استخراج فاز جامد برای تمیز کردن سریع اسیدنوکلئیک است. در این روش  اسیدنوکلئیک تحت شرایط خاصی  به فاز جامد سیلیس متصل می شود . در کیت استخراج RNA روش و اساس کار به ترتیب زیر است:

۱. لیز سلولی (Cell Lysis)

در این مرحله، سلول‌های نمونه با استفاده از بافرهای لیز کننده خاص شکسته می‌شوند. این بافرها حاوی ترکیباتی هستند که غشای سلولی را تخریب کرده و RNA را آزاد می‌کنند. همچنین، این بافرها آنزیم‌های RNase را غیرفعال می‌کنند تا از تخریب RNA جلوگیری شود. برای نمونه‌های بافتی، ممکن است از هموژنایزر یا آنزیم‌های خاص برای تسهیل فرآیند لیز استفاده شود.

۲. اتصال RNA به ستون سیلیکا (Binding)

پس از آزادسازی RNA، محلول حاوی RNA به ستون سیلیکا منتقل می‌شود. در این مرحله، با افزودن اتانول یا ایزوپروپانول به محلول، شرایطی فراهم می‌شود که RNA به غشای ژل سیلیکا متصل گردد. این اتصال بر اساس ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی RNA و سطح سیلیکا صورت می‌گیرد. سپس با استفاده از سانتریفیوژ، RNA به طور مؤثری به ستون متصل می‌شود

۳. شستشوی RNA متصل شده (Washing)

در این مرحله، برای حذف ناخالصی‌ها، پروتئین‌ها و سایر آلاینده‌ها، بافر شستشو به ستون افزوده می‌شود. با استفاده از سانتریفیوژ، این ناخالصی‌ها از ستون خارج شده و RNA خالص بر روی ستون باقی می‌ماند. این فرآیند ممکن است در چندین مرحله تکرار شود تا از خلوص بالای RNA اطمینان حاصل گردد.

۴. استخراج RNA خالص (Elution)

در مرحله نهایی، RNA از ستون سیلیکا جدا می‌شود. برای این منظور، بافر الوشن یا آب RNase-free به ستون افزوده می‌شود و با استفاده از سانتریفیوژ، RNA به لوله جمع‌آوری منتقل می‌شود. حجم معمول الوشن بین ۳۰ تا ۵۰ میکرولیتر است. RNA استخراج‌شده در این مرحله آماده استفاده در واکنش‌های مولکولی مانند RT-PCR، RNA-Seq و Microarray است.

مزایای روش ستونی

• سرعت و کارایی: این روش نسبت به روش‌های سنتی مانند فنول-کلروفرم سریع‌تر است و زمان کمتری برای استخراج RNA نیاز داردخلوص بالا: RNA استخراج‌شده دارای خلوص و کیفیت بالایی است که برای کاربردهای حساس مناسب است.

• سادگی و ایمنی: عدم نیاز به مواد شیمیایی سمی مانند فنول و کلروفرم، این روش را ایمن‌تر می‌کند.

• مناسب برای انواع نمونه‌ها: این روش برای انواع نمونه‌های بافتی، سلولی، خون و باکتری قابل استفاده است.

نکات مهم در استفاده از کیت‌های استخراج RNA ستونی

• استفاده از تجهیزات RNase-free: برای جلوگیری از تخریب RNA، باید از لوله‌ها، پیپت‌ها و دستکش‌های عاری از RNase استفاده کرد

• انجام مراحل در محیط مناسب: انجام مراحل استخراج در هود میکروبی و با رعایت شرایط استریل توصیه می‌شود.

• نگهداری RNA استخراج‌شده: RNA باید بلافاصله در دمای -۸۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود تا از تخریب آن جلوگیری گردد.

در نهایت، روش ستونی استخراج RNA به دلیل سرعت، کارایی و خلوص بالای RNA استخراج‌شده، یکی از روش‌های محبوب در آزمایشگاه‌های مولکولی است. با رعایت نکات فوق، می‌توان به نتایج دقیقی در تحقیقات مولکولی دست یافت.

نمونه های مورد استفاده در کیت استخراج RNA

با استفاده از کیت استخراج RNA توتال از نمونه های مختلف ، می توانید پروسه ی استخراج RNA را از طیف گسترده ای از نمونه ها انجام دهید . شما می توانید از نمونه هایی نظیر استخراج RNA از خون کامل ، استخراج RNA از سلول جانوری ، استخراج RNA از بافت جانوری ، استخراج RNA از باکتری ، استخراج RNA از مخمر و استخراج RNA از بافت پارافینه را انجام دهید.

بعلاوه در مورد نمونه های خاص مانند بافت های گیاهی با خرید محلول YTzol Pure RNA که فرمولاسیونی مشابه با ترایزول دارد و نیز ادغام دو روش ستونی و YTzol pure RNA می توانید با کمترین هزینه و بهینه ترین دستورالعمل جهت استخراج RNA برای نمونه های خاص و گیاهی اقدام کنید.

برای دستیابی به دستورالعمل های بهینه شده برای نمونه های متفاوت می توانید به بخش دستورالعمل در منو مراجعه بفرمایید .

به طور کلی پایه و اساس کار در کیت استخراج RNA  روش مبتنی بر ستون می باشد . ویژگی این روش در تمامی برند ها خلوص بالای RNA و مقدار محصول کم است ولی در مقابل با استفاده از محلول ترایزول ، کاربر محصول زیاد و با خلوص کمتری در اختیار دارد.

در این مواقع ، پیشنهاد می کنیم برای نمونه هایی که دارای مقدار قابل توجهی RNA هستند از کیت استخراج RNA استفاده کنید ولی اگر نمونه ی شما مقدار RNA کمتری دارد می توانید از محلول ترایزول با نام تجاری YTzol pure RNA استفاده کنید . در صورتیکه نمونه ی شما مقدار RNA کمی دارد و از طرفی درجه ی خلوص برای شما اهمیت دارد میتوانید  با استفاده از دستورالعمل بهینه شده  از هر دو روش در آزمایش خود استفاده کنید .

راهکار افزایش مقدار محصول RNA

در اینجا به بهینه سازی پروتکل های موجود می پردازیم و جهت  افزایش مقدار محصول RNA ، پیشنهاد می شود مراحل زیر را دنبال کنید :

با توجه به اینکه RNA موجود در خون به واسطه ی مقدار بالای Rnase  پایداری خیلی کمی نسبت به بافت دارد ، کاربر می بایست برای استخراج RNA از خون ، تا حد امکان از نمونه ی تازه خون استفاده نماید و تا حد امکان از نمونه های فریز شده اجتناب کند . همچنین  بهترین اقدام این است که بافی کوت خون را استخراج نماید و سریعا پروسه ی استخراج RNA  را آغاز کند و یا اینکه برای بافت قبل از شروع پروسه ی استخراج RNA از بافت ، از محلول RNAlater استفاده کند و پروسه ی استخراج RNA را به زمانی دیگر موکول کند .

نکته بسیار مهم در این فرآیند  اجتناب از فریز و یخ زدایی نمونه به صورت متناوب است.

نتیجه‌گیری

روش استخراج RNA به‌وسیله کیت‌های ستونی، به‌ویژه در زمینه‌های تحقیقاتی و آزمایشگاهی، به دلیل سرعت بالا، سادگی اجرا و کیفیت مطلوب RNA استخراج‌شده، به‌عنوان یک استاندارد معتبر شناخته می‌شود. این روش با استفاده از ستون‌های سیلیکا، امکان جداسازی مؤثر RNA از نمونه‌های مختلف بیولوژیکی را فراهم می‌آورد. با رعایت دقیق مراحل پروتکل و استفاده از مواد و تجهیزات مناسب، می‌توان به نتایج قابل‌اعتماد و با کیفیت دست یافت.