عملکرد کیت سنتز cDNA و محتویات

 complementary DNA ( cDNA)

عبارت cDNA برگرفته از لغت  complementary DNA است که به واسطه ی حضور آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ( Reverse transcriptase ) ساخته می شود . این آنزیم با کمک از توالی نوکلئوتیدی RNA ، مکمل DNA  یا cDNA را در قرینه ی آن قرار می دهد . یکی از محصولات تولیدی شرکت یکتا تجهیز آزما ، کیت سنتز cDNA می باشد که آنزیم موجود در این کیت از بهترین کمپانی اروپایی خریداری شده و توانستیم نیاز کاربران را در تامین کیت سنتز cDNA در ایران برطرف نماییم . این آنزیم تحت عنوان های  آنزیم وارونویس ، رونوشت بردار معکوس ، ترانس کریپتاز معکوس و نیز آنزیم RT و یا آنزیم  Reverse transcriptase خوانده می شود .

آنزیم RT

این آنزیم که در کیت سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفته است ، از نوع H Minus ( H- ) بوده و از ویروس  Moloney Murine Leukemia   و یا به اختصار MMLV استخراج شده است . از جمله امتیازات این آنزیم توانایی تحمل حرارت می باشد که نسبت به آنزیم های دیگر بالاتر است . فعالیت آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ( MMLV ) که از محصولات بسیار ارزشمند شرکت یکتاتجهیزآزما می باشد ،  در 50 درجه سانتی گراد ، به طور کامل پایدار است و در دمای 55 درجه سانتی گراد تا 80 درصد فعالیت آن حفظ می شود.

این آنزیم ها  می توانند از روی  مولکول RNA ، سنتز  DNA را انجام دهند . DNA مکمل یا  cDNA  به رشته ای از مولکول DNA گفته می شود که به واسطه ی  فعالیت های آنزیم MMLV ( رونوشت بردار معکوس ) از روی رشته ی RNA ساخته شده است . از جمله کاربردهای cDNA می توان به کلون کردن ژن در سلول‌ها ، ساخت کتابخانه cDNA و نیز به‌ عنوان پروب در آنالیز ژن‌ها اشاره کرد . البته از برجسته ترین کاربرد آن  بررسی سطح بیان ژن ها به صورت کمی می باشد .

آنزیم های RT و یا رونوشت بردار معکوس انواع مختلفی دارند که معمولا منشا ویروسی دارند و انواع مختلف آنها در بازار بیولوژی مولکولی بر اساس نیاز کاربر موجود می باشد.

یک سری از RNA ویروس های تک رشته ای که سبب بروز عفونت در سلول های جانوری می شوند ، دارای مولکول DNA پلیمراز وابسته به RNA  تحت نام ترانس کریپتاز معکوس ( Reverse Transcriptase) در ذره ی ویروسی هستند .

زمانی که عفونت در داخل سلول جانوری رخ می دهد ، ژنوم RNA ویروسی با وجود ده هزار نوکلئوتید با همراهی آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (Rreverse transcriptase ) و نیز یک tRNA به عنوان حمل کننده ی آنزیم ، از سلول میزبان خود به یک سلول میزبان جدید منتقل می گردد.

محتویات کیت سنتز cDNA

کیت سنتز cDNA دارای شش قسمت می باشد که همگی از موارد اصلی و مورد نیاز در سنتز cDNA به شمار می آیند :

M-MLV (10,000 U)     Concentration: 200u/ μl

5X first-strand Buffer

Oligo(dT)18 primer

Random hexamer primer

RNasein   40u/μl

dNTP 10mM

همان طور که در بالا به اجزای کیت اشاره کردیم ، یک واکنش سنتز cDNA دارای موارد زیر می باشد:

• آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ( آنزیم  RT یا آنزیم وارونویس ) که منشا ویروسی دارد مانند MMLV ، HIV-1 و AMV که در کیت تولیدی یکتا تجهیز آزما از نوع MMLV (H-) استفاده شده است .
• بافر مخصوص  آنزیم ترانس کریپتاز معکوس که کاملا بهینه با کیت سنتز cDNA  و با غلظت 5X تولید شده است .
• پرایمر های مخصوص واکنش سنتز cDNA که به طور معمول از دو نوع پرایمر Oligo dT و Random Hexamer استفاده می شود.  گاهی اوقات کاربر بر حسب نیاز ، تقاضای پرایمر اختصاصی جهت mRNA هدف می نماید.
• محدود کننده RNA که با غلظت 40 یونیت در ماکرولیتر برای این کیت در نظر گرفته شده است و از تولیدات شرکت یکتا تجهیز آزما می باشد .
• چهار نوع نوکلئوتید ( dNTP ) با غلظت 10mM

آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (  آنزیم MMLV ) با غلظت 200 یونیت در ماکرولیتر و در حجم 10,000 یونیتی برای این کیت در نظر گرفته است و این کیت  در بسته بندی 50 تستی ارائه می گردد . کاربران عزیز می توانند برای بررسی و مشاهده ی دستورالعمل به وبسایت شرکت یکتا تجهیز آزما مراجعه کرده و در قسمت محصولات و زیر مجموعه ی RT-PCR ، به مشخصات محصول و پروتکل آپلود شده دسترسی پیدا کنند .