عیب یابی در واکنش PCR

عیب یابی در واکنش PCR

بعد از بردن محصول پی سی آر بر روی ژل ، یک باند ضعیف و گاهی هیچ باندی مشاهده نشد. پیشنهاد شما برای حل این مشکل چیست؟

اولین و رایج ترین مشکل پیش آمده در تکنیک PCR عدم مشاهده باند یا مشاهده باند ضعیف بعد از انجام واکنش pcr بر روی  ژل آگارز می باشد. پیشنهاد می شود موارد زیر را مورد بررسی قرار دهید:

• تعداد کم سیکل در pcr

  زمانی که غلظت نمونه زیاد است از سیکل های کمتری استفاده کنید و زمانی که غلظت نمونه کم است از سیکل های بیشتری استفاده کنید.

• زمان extantion کم است

• زمان اتصال پرایمر به هدف (annealing)

  اگر کم باشد پرایمرها زمان کافی برای اتصال به هدف را نخواهند داشت بنابراین حداقل زمان 30 ثانیه را در نظر بگیرید. اگر زمان اتصال پرایمر به هدف (annealing) بسیار زیاد باشد هم پنین نتیجه ای را مشاهده خواهید کرد. قاعده کلی این است که از دمای اتصالی استفاده کنید که 5 درجه سانتیگراد کمتر از Tm پرایمر باشد.

• زمان و دمای denaturation

  اگر مدت زمان باز شدن دو رشته از هم یا دمای باز شدن دو رشته از هم کم باشد دو رشته ای dna به خوبی از هم باز نشده و کارایی تکثیر کاهش می یابد. به همین ترتیب با افزایش زمان دو رشته ای شدن dna ، نمونه تخریب شده و نتایج مطلوب حاصل نمی شود. پیشنهاد می شود برای denaturation اول از دمای 95 و زمان 3 دقیقه و برای denaturation داخل سیکل از دمای 95 به مدت 30ثانیه استفاده کنید.

• نمونه مورد استفاده

  غلظت و کیفیت نمونه مورد استفاده بسیار مهم است. نمونه ممکن است غلطظت بسیار اندک داشته یا کیفیت پایینی داشته باشد و حاوی مهارکننده های PCR باشد. در صورت احتمال وجود مهارکننده ها پیشنهاد می شود  نمونه موجود را رقیق کنید. بهتر از یک نمونه مطمئن به عنوان کنترل کیفیت جهت بررسی کیفیت نمونه خود استفاده کنید. دقت داشته باشید از مقدار مناسب نمونه برای انجام واکنش استفاده کنید.

• غلظت پرایمر مورد استفاده

  انتخاب غلظت مناسب پرایمر برای انجام واکنش یک مسئله ضروری می باشد. اگر غلظت پرایمر زیاد باشد احتمال اتصال غیراختصاصی افزایش می یابد و چنانچه غلظت پرایمر در واکنش کم باشد اتصال پرایمر به الگو ناکارآمد و با بازدهی پایین خواهد بود.

• مسترمیکس استفاده شده در واکنش pcr

  دقت کنید که مستر میکس مورد استفاده در pcr باید با واکنش طراحی شده تطابق داشته باشد. بنابراین در انتخاب مسترمیکس دقت کنید.

در نتایج pcr بر روی ژل باند غیراختصاصی یا پرایمر دایمر مشاهده کردیم ،راهکار شما برای برای عیب یابی در واکنش PCR و این مشکل چیست؟

پیشنهاد ما در وهله اول بررسی پرایمر های مورد استفاده است. بررسی کنید که پرایمرها به درستی طراحی شده باشند و به درستی سنتز شده باشند. جهت حصول نتیجه مناسب بهتر است غلظت مناسب از پرایمر را مورد استفاده قرار دهید. غلظت بالای پرایمر امکان شکل گیری پرایمر دایمر و باند غیراختصاصی را افزایش می دهد. پیشنهاد می شود غلظت پرایمر را کاهش داده و آزمایش را تکرار کنید. غلظت منیزیم به کار برده شده نیز اهمیت دارد. غلظت بالای منیزیم می تواند منجر به شکل گیری باند غیراختصاصی شود.

• راه حل شما برای مشاهده اسمیر بعد از انجام واکنش پی سی آر بر روی ژل آگارز چیست؟

پیشنهاد می شود موارد زیر را در واکنش مورد بررسی قرار دهید:

• تعداد سیکل های به کار برده شده

  اگر تعداد سیکل ها بالا باشد امکان تشکیل باندهای غیراختصاصی و خطا در واکنش می شود. پیشنهاد می شود تعداد سیکل را کاهش دهید و واکنش را تکرار کنید.

• زمان extension 

  اگر زمان extension بسیار طولانی باشد و با طول محصول تناسب نداشته باشد باندهای غیراختصاصی بدین شکل دیده می شود. توصیه می شود از زمان extension متناسب با واکنش خود استفاده کنید.

• زمان extension

  زمان extension طولانی و نامتناسب با واکنش و طول محصول مورد نظر می تواند منجر به شکل گایری باندهای غیراختصاصی به شکل اسمیر می شود.

• غلظت نمونه مورد استفاده

  اگر غلظت نمونه خیلی زیاد باشد نتیجه می تواند به صورت اسمیر دیده شود. پیشنهاد می شود غلظت نمونه را کاهش داده و واکنش را تکرار کنید.

• کیفیت نمونه مورد استفاده

  اگر نمونه به هر دلیلی کیفیت پایینی داشته باشد و شکسته باشد نتیجه تکثیر به صورت اسمیر دیده خواهد شد.

• پیشنهاد شما برای حل مشکل حضور مهارکننده ها در واکنش پی سی آر چیست؟

مهارکننده های واکنش شامل حضور فنول، EDTA و یا پروتیئن ها در نمونه می باشد. پیشنهاد می شود نمونه را در صورت امکان رقیق کنید تا غلظت مهارکننده ها کاهش یابد. اقدام دیگر در صورت امکان می تواند خالص سازی مجدد نمونه باشد. بنابراین قبل از انجام واکنش حتما کیفیت DNA مورد استفاده را مورد بررسی قرار دهید.