PCR چیست؟ | مراحل PCR | کاربرد PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی است که انقلابی در حوزه تحقیقات ژنتیکی، پزشکی و زیست‌شناسی ایجاد کرده است. این تکنیک امکان تکثیر دقیق و سریع بخش‌های خاصی از DNA را فراهم می‌کند و در بسیاری از زمینه‌ها از جمله تشخیص‌های پزشکی، پزشکی قانونی، کشاورزی و پژوهش‌های علمی کاربرد دارد. در این مقاله به معرفی دقیق اصول، اجزا، مراحل و کاربردهای این روش پرداخته خواهد شد.

اصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بر مبنای توانایی DNA پلیمراز در سنتز رشته جدید DNA با استفاده از یک الگو و پرایمر عمل می‌کند. DNA پلیمراز، آنزیمی است که می‌تواند نوکلئوتیدها را به رشته DNA موجود اضافه کرده و یک رشته مکمل بسازد. PCR شامل چندین چرخه از مراحل حرارتی است که به صورت متوالی تکرار می‌شوند و در هر چرخه مقدار DNA هدف دو برابر می‌شود.

اجزای اصلی واکنش PCR

برای انجام PCR، اجزای خاصی مورد نیاز است که در ادامه معرفی می‌شوند:

1- آنزیم DNA پلیمراز:

• آنزیمی که برای سنتز رشته جدید DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد. در اغلب واکنش‌های PCR از آنزیم Taq پلیمراز، که از باکتری ترموس آکواتیکوس استخراج شده، استفاده می‌شود. این آنزیم به دلیل پایداری حرارتی بالا در دماهای بالای چرخه PCR بسیار مناسب است.

اساس کار PCR :

اساس کار واکنش  PCR نیز مانند پروسه ی همانندسازی DNA ، بر مبنای  آنزیم DNA پلیمراز است . آنزیم Taq  پلیمراز، رشته جدید DNA  را از روی DNA الگو کاتالیز می کند . این آنزیم از باکتری  ترموس آکواتیکوس که مقاوم به گرما است ، گرفته می شود . محل  زندگی این باکتری ها در چشمه‌های آب داغ  و دریچه‌های گرمابی است. از آنجا که این دریچه‌های گرمایی در عمق دریا و اقیانوس و در نزدیکی جایگاه ‌های فعال آتشفشانی قرار داشته و نیز محل خروج هوای گرم هستند، از این رو آنزیم‌های این باکتری، از جمله DNA پلیمراز، نسبت به گرما پایداری بالایی دارند. به گونه ای که فعال ترین حالت این آنزیم در دمای 70 درجه سانتیگراد است . باید توجه داشته باشید که در این دما بیشتر آنزیم‌های انسانی، غیرفعال می شوند.

در زیر به توضیح سه عبارت علمی در زمینه ی آنزیم ها می پردازیم :

• پایداری گرمایی و یا به عبارتیHeat-Stability به مقاومت آنزیم در نگهداری ساختار سه‌بعدی و عملکرد خود در دماهای بالاتر از محیط گفته می شود .
• قدرت پردازش یا Processivity به مقاومت آنزیم در حفظ اتصال به سوبسترا تا انتهای واکنش گفته می شود .
• صحت عملکرد یا Fidelity  به توانایی اتصال مولکول صحیح، در جای مناسب گفته می شود. در مورد پلیمرازها، این خصوصیت، منجر به قرارگیری مولکول مکمل در مقابل هر نوکلئوتید می شود.

فعالیت آنزیم :

یکی از عواملی که آنزیم Taq  پلیمراز را برای انجام واکنش PCR  مناسب و ایده آل می سازد، مقاومت گرمایی این آنزیم است ، چون در طی واکنش PCR  دما بطور متناوب افزایش می یابد تا رشته های DNA الگو از هم باز شده و دوباره تکثیر آغاز شود. فعالیت آنزیم Taq  پلیمراز در دمای 70 درجه سانتی گراد به طور ویژه ای  افزایش می یابد  و در دمای حدود 90 درجه سانتیگراد یا بالاتر ، بدون تغییر در فعالیت آنزیم ، ساختار آن حفظ می‌ شود و با پایین آمدن دما، دوباره به حالت فعال خود بازمی‌گردد.

در زیر فعالیت این آنزیم را در دماهای مختلف می توانید بررسی کنید:

از دیگر عوامل مهم در مورد آنزیم  Taq DNA polymerase ، توانایی پردازش بالای آن است ، به طوری که قادر هستند قطعاتی به طول سه هزار نوکلئوتید را پردازش کنند  و حتی میتوان با ایجاد کمی تغییر در شرایط ، این عدد را تا چهار هزار نوکلئوتید هم افزایش داد و این توانایی را بهینه کرد. از دیگر خصوصیات بارز آنزیم  Taq DNA polymerase  ، صحت عملکرد و توانایی  proofreading یا ویرایش خطا است  که در Taq پلیمرازهای رایج به ازای هر سه هزار باز ، یک نوکلئوتید غلط است .

2- پرایمرها:

• پرایمرها توالی‌های کوتاه DNA تک‌رشته‌ای هستند که به نواحی مکمل خود در DNA الگو متصل می‌شوند و نقطه شروع سنتز DNA را تعیین می‌کنند. طراحی مناسب پرایمرها نقش مهمی در دقت و کارایی واکنش دارد.

توضیحات تکمیلی :

آنزیم Taq پلیمراز فقط در حضور پرایمر توانایی سنتز رشته جدید را دارد . در واقع پرایمرها، اولیگونوکلئوتیدهایی از جنس DNA هستند که سر OH آزاد را در اختیار آنزیم قرار می دهند و یک نقطه آغاز را در برای آن تعیین می کنند. به عبارت دیگر این نقطه شروع ، همان گروه هیدروکسیل آزاد موجود در انتهای 3′ آخرین نوکلئوتید مولکول پرایمر می باشد.

پرایمرهای لازم در واکنش زنجیره‌ ای پلیمراز ( PCR   ) قطعه‌های کوتاهی از یک DNA تک رشته‌ای هستند که عموما طولی در حدود 20 نوکلئوتید دارند. طراحی این قطعات به گونه ای است که ناحیه هدف را در بر بگیرند. بنا براین در هر واکنش  PCR ، دو پرایمر جهت اتصال به هر یک از دو رشته ی DNA لازم است  و این اتصال به وسیله پیوند هیدروژنی بین پرایمر و DNA الگو  انجام می گیرد . پرایمر متصل به این رشته forward primer   و پرایمر متصل به رشته مکمل  reverse primer  نام دارند .

3- نوکلئوتیدها (dNTPs):

• نوکلئوتیدها واحدهای سازنده DNA هستند که شامل آدنوزین‌تری‌فسفات (ATP)، گوانوزین‌تری‌فسفات (GTP)، سیتیدین‌تری‌فسفات (CTP) و تیمیدین‌تری‌فسفات (TTP) می‌باشند.

4- DNA الگو:

• نمونه DNA که شامل توالی هدف مورد نظر برای تکثیر است.

5- بافر واکنش:

• محیطی که شرایط بهینه برای فعالیت آنزیم و پایداری DNA را فراهم می‌کند. این بافر معمولاً شامل یون‌های منیزیم است که برای عملکرد DNA پلیمراز ضروری هستند.

توضیحات تکمیلی :

فعالیت هر آنزیمی در یک شرایط  ویژه ای  در بالاترین حد خود است . در واقع ، بافرها کمک می کنند که این شرایط خاص تشکیل و تا انتهای واکنش حفظ شود .بافر آنزیم Taq پلیمراز که معمولا در غلظت 10X است ، شامل Tris HCl ،‌   KClو معمولا MgCl2 می باشد.  Tris HCl  به پایداری  pH بین 8 تا 9.5 کمک می‌کند.  در واقع دو عامل در این بافر نقش مهمی دارند :  اولی وجود یون پتاسیم که منجر به استحکام  فرایند اتصال پرایمرها به الگو،‌ هنگام آنیلینگ می‌شود و دیگری وجود یون منیزیم  که همچون کوفاکتور آنزیم پلیمراز، به آن متصل خواهد شد تا آن را به بالاترین فعالیت ساختاری خود برساند.

مراحل واکنش PCR

PCR شامل سه مرحله اصلی است که در هر چرخه تکرار می‌شوند:

1. دناتوراسیون (Denaturation):

   • در این مرحله، نمونه به دمای 94-98 درجه سانتی‌گراد گرم می‌شود تا دو رشته DNA از یکدیگر جدا شوند. این مرحله معمولاً 20 تا 30 ثانیه طول می‌کشد.

2. اتصال (Annealing):

   • دمای واکنش به 50-65 درجه سانتی‌گراد کاهش می‌یابد تا پرایمرها به توالی مکمل خود روی DNA الگو متصل شوند. این دما بسته به طراحی پرایمرها تعیین می‌شود و معمولاً 20-40 ثانیه طول می‌کشد.

3. طویل‌سازی (Extension):

   • دما به حدود 72 درجه سانتی‌گراد افزایش می‌یابد که دمای بهینه برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز است. در این مرحله، آنزیم نوکلئوتیدها را به انتهای پرایمرها اضافه کرده و رشته جدید DNA را سنتز می‌کند.

این سه مرحله در چرخه‌های متوالی (معمولاً 25 تا 35 چرخه) تکرار می‌شوند تا مقدار کافی از DNA هدف تولید شود.

در این مرحله، دما به حدود 72 درجه سانتی‌گراد افزایش می‌یابد که دمای بهینه برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز است. آنزیم نوکلئوتیدها را به انتهای پرایمرها اضافه کرده و رشته جدید DNA را می‌سازد. طول مدت این مرحله به اندازه توالی هدف بستگی دارد، به‌طوری‌که معمولاً برای توالی‌های کوتاه‌تر (تا 1000 جفت باز) 30 ثانیه کافی است. برای توالی‌های بلندتر، زمان بیشتری نیاز است.

در طول چرخه‌های متوالی (معمولاً 25 تا 35 چرخه)، مقدار DNA هدف به صورت نمایی افزایش می‌یابد و در پایان، مقادیر زیادی از توالی مورد نظر تولید می‌شود.

کاربردهای PCR

از متداول ترین کاربردهای  واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) میتوان به موارد زیر اشاره کرد:

• بررسی و مطالعه ی ژن‌های موثر در یک بیماری
• بررسی و مطالعه ی فاکتورهای بیماری عفونی
• تشخیص پزشکی مناسب
• تکثیر یک قطعه از رونوشت ژن یا Reverse Transcriptase PCR
• جهت احراز هویت
• بررسی دقیق تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن یا Real-Time PCR
• بررسی تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن در مقایسه با ژن دیگر یا Semi-quantitative PCR

1. تشخیص بیماری‌ها:
   • PCR ابزاری حیاتی در تشخیص عوامل بیماری‌زا مانند ویروس‌ها (از جمله ویروس کرونا)، باکتری‌ها و انگل‌ها است. این تکنیک به‌ویژه در تشخیص سریع بیماری‌های عفونی بسیار مؤثر است.
2. پزشکی قانونی:
   • در حوزه پزشکی قانونی، PCR برای تحلیل DNA از نمونه‌های کوچک مانند مو، خون یا بزاق استفاده می‌شود. این روش به تعیین هویت افراد و شناسایی مجرمان کمک می‌کند.
3. تحقیقات ژنتیکی:
   • PCR در کشف و بررسی ژن‌ها، مطالعه جهش‌های ژنتیکی و درک بهتر بیماری‌های ژنتیکی نقش کلیدی دارد.
4. بیوتکنولوژی و زیست‌شناسی مولکولی:
   • از PCR برای کلونینگ ژن، مطالعه بیان ژن و تولید DNA برای مقاصد مختلف استفاده می‌شود.
5. کشاورزی:
   • در صنعت کشاورزی، PCR برای شناسایی بیماری‌های گیاهی، اصلاح ژنتیکی و شناسایی موجودات اصلاح‌شده ژنتیکی (GMO) کاربرد دارد.

مزایا و محدودیت‌های PCR

مزایا:

• حساسیت بالا: قادر به تکثیر DNA از مقادیر بسیار کم نمونه.
• سرعت: فرآیند PCR می‌تواند در مدت چند ساعت کامل شود.
• تطبیق‌پذیری: قابلیت استفاده در کاربردهای متنوع.

محدودیت‌ها:

• حساسیت بالا به آلودگی‌ها که می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود.
• نیاز به تجهیزات خاص مانند دستگاه ترموسایکلر.
• محدودیت‌هایی در تکثیر بخش‌های طولانی DNA.

انواع PCR

با ایجاد کمی تغییر در اجزا یا وضعیت دمایی PCR، می‌توانیم  این واکنش را برای اهداف متفاوتی ایده آل کنیم که در زیر به چند مورد آن اشاره میکنیم :

• qPCR یا ریل تایم پی سی آر RT-PCR
• Multiple PCR
• Nested PCR
• High Fidelity PCR
• Fast PCR
• Hot Start PCR
• GC-Rich PCR
• Long-range PCR
• Arbitrary Primed PCR

الکتروفورز محصولات PCR

برای مشاهده نمونه‌ ها روی ژل، هنگام قرار دادن آن‌ ها درون چاهک،از رنگ‌ های قابل مشاهده با نور UV مانند رنگ سیف استین DNA safe stain  استفاده می شود.

البته در گذشته، از اتیدیوم بروماید برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شد، اما به دلیل سمی و جهش‌زا بودن آن ها، کار با آن‌ها در آزمایشگاه ها ممنوع اعلام شد. پس از پایان حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل توسط دستگاهی به نام ژل داک تصویربرداری میشود.

با این تکنیک کاربر قادر به شناسایی مولکولهای DNA با طول های متفاوت است. از آنجاییکه مولکول‌های DNA دارای بار منفی هستند زمانی که روی ژل  و تحت جریان الکتریی قرار میگیرند به سمت الکترود مثبت حرکت می‌کنند. در این شرایط ، جداسازی مولوکول های DNA ، تنها بر اساس اندازه و سایز آنها انجام می‌شود. حرکت رشته‌های کوتاه DNA سرعت بیشتری نسبت به مولکول‌های بلندتر دارند، بنابراین جداسازی  مولکول‌های DNA با اندازه‌های متفاوت آسان تر انجام میشود.همانطور که قبلا هم اشاره کردیم ردیابی نمونه ها، با اضافه کردن رنگهای فلورسنت درون چاهک ژل  انجام میگیرد. بعضی از کاربران، رنگ‌های فلورسنت را با ژل ، درست قبل از انتقال آن به قالب الکتروفورز مخلوط میکنند که در این شرایط ، نیاز به اضافه کردن رنگ هنگام لود نمونه  نیست. الکتروفورز برای مولکول‌های‌ DNA به صورت افقی انجام می‌گیرد که روشی ساده‌تر نسبت به روش عمودی است.

بعد از توقف جریان، باند مولکول‌های DNA در اندازه‌های مختلف بر روی ژل نمایان است که جهت تعیین اندازه باند نمونه، از یک نشانگر و یا در اصطلاح  (Ladder) به عنوان استاندارد استفاده می‌شود. Ladder ( لدر ) روی ژل به صورت باندهایی با طول معین نمایان بوده و با استفاده از آن اندازه باندهای نمونه بر روی ژل را می توان ارزیابی کرد.