استخراج DNA از گیاه

نگهداری از اطلاعات ژنتیکی گیاهان

حفاظت و مراقبت از اطلاعات ژنتیکی و توارثی گیاهان در دنیا از ارزش شایانی برخوردار است . یکی از مسئولیت های بانک های ژن در سراسر دنیا ، جمع آوری ، حفظ و نگهداری منابع و اطلاعات  ژنتیکی گیاهان به ویژه گیاهان وحشی می باشد . این اقدام با اهداف متفاوتی صورت می گیرد و بسیار مورد توجه قرار گرفته است . از جمله دلایل اهمیت این موضوع  ، می توان به بررسی و مطالعه ی تنوع ژرم پلاسم اشاره کرد . ژرم پلاسم به هر نوع ماده ی گیاهی که در تولید و اصلاح نژاد کاربرد دارد ، گفته می‌شود و می تواند بذر، گیاه کامل و یا بافت‌های گیاهی باشد . در واقع حفاظت از این اطلاعات ، اساس بهینه کردن نژاد گیاهی و توسعه علوم کشاورزی است . با جداسازی DNA از بافت های گیاهی با صفات مطلوب می توان برای اصلاح گیاهان استفاده کرد . یکی از صفات مطلوب در گونه های متفاوت گیاهان ، مقاومت در برابر آفت کش ها و تزریق آنها به ژنوم گیاه است  و زمانی که گیاه به بلوغ می رسد دانه های آن ها ژنهای اصلاح شده را به ارث می برند. اصلاح نژاد گیاهان و بهره گیری از علوم ژنتیکی در کشاورزی منجر به صرفه جویی در مصرف زمان و انرژی و هزینه های گزاف می شود .

فاکتورهای جمع آوری ژنتیکی گیاهان

توسعه ی جمع آوري گياهان بر اساس چهار فاکتور در هر منطقه جغرافیایی انجام می گیرد :

1) عمل نمونه گيري از حدود 50 جمعيت در يک منطقه جغرافيايي

2) عمل نمونه گيري از 50 گياه در هر جمعيت

3) نمونه گيري تصادفي در هر منطقه برداشت

4) نمونه گيري کافي از بذرها و يا مواد رويشي هر بوته گياهي

البته در طرح های جمع آوري ، گونه و جمعيت هاي در حال فرسايش ژنتيکي  از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند .

استخراج DNA از گیاه

یکی از موارد مهم در استخراج DNA ژنومي گیاهان با کميت و کيفيت مطلوب در آزمايشگاه هاي ژنوميکس  است . استخراج DNA از بافت هاي گياهي با فراز و نشیب های خاص خود همراه است . به عنوان مثال استخراج DNA از بافت های چوبي مانند درختان ميوه علاوه  بر وجود کربوهيدرات ها که اثر منفی بر کیفیت DNA دارند ، موانعی مانند مواد پلي فنولي نیز وجود دارد که می تواند بر کيفيت DNA اثر منفي بگذارد ، هر دوی این متابولیت ها، در استفاده از DNA برای اهداف زیست‌شناسی مولکولی، مانند هضم محدود انزیمی، PCR، یا تعیین توالی (مانند توالی‌یابی نسل بعدی)، با مهار عمل پلیمرازها یا اندونوکلئازها، اختلال ایجاد می‌کنند. برخی از گونه‌های گیاهی نیز احتمالاً حاوی سطح بالایی از متابولیت‌های خاص هستند که استخراج DNA را سخت‌تر می‌کند. به عنوان مثال، غلات غنی از کربوهیدرات هستند، در حالی که گیاهان تحت استرس غنی از پلی فنول هستند. یک راه برای غلبه بر این مسائل، جستجوی پروتکل هایی است که در از بین بردن این آلاینده ها تخصص دارند.

روش های مختلف برای استخراج DNA گیاهی

برای چندین دهه، پروتکل مرسوم برای استخراج کارآمد و مطمئین DNA از گیاهان، استخراج ستیل تری متیل آمونیوم بروماید (CTAB) بوده است که برای اولین بار در سال 1987 توسعه یافت. در طول سالها تغییرات فنی در پروتکل انجام شده است تا آن را برای گونه‌های مختلف گیاهی کاربردی‌تر کند. به‌علاوه، پروتکل‌هایی که شامل مرحله   bead beatingهستند، به‌ویژه برای گونه‌های گیاهی با دیواره‌های سلولی ضخیم که به سختی از هم جدا می‌شوند، مفید بوده‌اند.

روش‌های مبتنی بر ستون با استفاده از غشای سیلیکا، تحت شرایطی که اتصال DNA را تقویت می‌کنند، نیز ظاهر شده‌اند. به طور مشابه،  بیدهای مغناطیسی برای استخراج DNA گیاه استفاده می شود و (مانند روش های مبتنی بر ستون) امکان شستشو و خالص سازی موثر DNA را فراهم می کند.

بنابراين بهترین روش استخراج DNA ژنومی از بافت گیاهان باید سازگار با بافت گیاهی بوده و این موانع را به حداقل برساند  و نتیجه استخراج DNA ، از نظر کیفی و کمی مطلوب باشد .  ارزیابی  کميت DNA ژنومي استخراج شده بوسیله ی اسپکتروفتومتري ، الکتروفورز روی ژل آگارز، برش با آنزيم هاي برشگر و نیز واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR) انجام می گیرد.

همان طور که گفته شد مهمترین فاکتور علوم زیست مولکولی ، استخراج DNA ژنومی با کیفیت و کمیت مطلوب می باشد . استخراج DNA از نمونه های گیاهی با اهداف مختلف از طبیعت جمع آوری شده و مورد بررسی و مطالعه قرار می گیرد که استخراج DNA از بافت گیاهی به دلیل حضور کربوهیدرات ها ، ترکیبات پلی فنولی و پروتئین ها با مشکلاتی روبرو است چرا که این ترکیبات به شکل مجموعه ای با اسیدهای نوکلئیک ترکیب می شوند و جداسازی آنها به مراتب سخت تر است .

انتخاب بافت گیاهی مناسب برای استخراج DNA اغلب یکی از حیاتی ترین تصمیم ها برای به دست آوردن مقادیر زیادی DNA برای طیف گسترده ای از کاربردهای پایین دست است. به طور کلی، بافت جوان تر ترجیح داده می شود زیرا معمولاً حاوی مقادیر کمتری متابولیت های ثانویه است. با این حال، DNA نیز از نمونه های هرباریوم و بافت های مومیایی شده نیز به دست آمده است. از آنجایی که DNA در تمام سلول های سوماتیک (همه سلول های تشکیل دهنده گیاه به جز سلول های جنسی) یکسان است، اکثر محققان از برگ های جوان به عنوان ماده اولیه استفاده می کنند. با این حال، زمانی که برگ ها در دسترس نیستند، یا در مورد ژیمنوسپرم ها، محققان از انواع دیگر بافت ها استفاده کرده اند. این انواع بافت شامل دانه ها، تبرهای جنین زا، جوانه ها و ساقه ها هستند.

موانع استخراج DNA از گیاه

همانطور که اشاره شد موانع متعددی برای استخراج DNA از اندام های گیاهی وجود دارد و وجود ترکیباتی نظیر متابولیت های ثانویه ، دستیابی به DNA با کیفیت مطلوب را محدود و گاهی غیر ممکن می سازد . محققان و پژوهشگران از روش های متفاوتی برای استخراج بهینه ی DNA از بافت گیاهی  استفاده می کنند ولی اغلب برای هر گیاه با توجه به نوع بافت آن باید یک روش خاص را انتخاب کرد و در بیشتر مواقع با کمی تغییرات می توان به نتیجه ی دلخواه رسید .

به عنوان مثال در مورد گیاه بابونه که یکی از گیاهان دارویی مهم محسوب می شود و همیشه مورد توجه پژوهشگران  بوده است تحقیقی انجام شد . در این تحقیق برای استخراج DNA از برگ گیاه از سه روش متفاوت استفاده شد که روش CTAB بهترین نتیجه را در استخراج DNA از بافت گیاهی داد .

استخراج DNA از بافت گیاهی

فرآیند استخراج DNA از بافت های گیاهی برعکس بافت های جانوری ،با مشکلات و پیچیدگی های خاصی رو به رو است و گاهی محقق و یا پژوهشگر با مقدار محصول DNA و یا غلظت پایین محصول DNA   روبرو می شود که منجر به تولید باند در واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) نمی شود . شرکت های تجاری بسیاری اقدام به تولید کیت  استخراج DNA از بافت گیاهی کرده اند تا نیاز کاربر را برطرف و مشکلات احتمالی را مرتفع سازند . حتی گاهی اوقات هنگام استفاده از این کیت ها ، محصول DNA با کیفیت های متفاوت را در دسترس کاربر قرار می دهد بطوریکه زمانیکه به سبب بررسی کیفیت و کمیت آن اقدام به آزمودن DNA بر روی ژل می کنند ، منجر به تولید باند می شود اما قابل انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) نیست .  بعضی از محققان و پژوهشگران با تغییر در دستورالعمل های متفاوت به آزمون و خطا می رسند و نهایت بهترین دستورالعمل را برای استخراج DNA از بافت گیاهی را انتخاب می کنند . بعضی از محققان کشورمان با بهینه سازی دستورالعمل ها به نتیجه دلخواه رسیده اند و از آن به عنوان بهترین روش استخراج DNA از گیاه یاد می کنند.

در سالهای اخیر با توسعه علوم ژنتیک در اکثریت آزمایشگاه های دنیا ، برای بررسی و مطالعه ی توالی و عملکرد ژنوم موجودات زنده ، روش هایی برای استخراج DNA از نمونه های گیاهی در نظر می گیرند .  یکی از روش های ارزیابی و اندازه گیری مولکول DNA ، استخراج DNA می باشد . همانطور که اشاره شد روشهای متفاوتی برای استخراج DNA از نمونه های گیاهی پیشنهاد شده است که هر کدام با توجه به بافت و نوع ترکیبات نمونه ، متفاوت است .

اولین قدم در مطالعه و پژوهش ویژگی های مولکولی ، مطالعات وراثتی و بیوتکنولوژی ، استخراج DNA  با کیفیت بالا و خلوص کافی است ولی همچنان با پیشرفت علوم ژنتیکی و نیاز عصر حاضر به تکنیک های ژنتیکی ، همچنان محققان با یک سری مشکلات در آزمایشگاه ها رو به رو هستند . با افزایش مقدار آزمایش ها  و نیاز حجم زیاد نمونه ها و نیز ترکیبات متابولیک برخی  از نمونه ها و محدودیت هایی که برخی از کیت های تجاری دارند و حتی با وجود دستورالعمل های کارآمد در رابطه با استخراج DNA  از بافت گیاهی ، سبب شده  تا محققان و پژوهشگران وقت زیادی را در آزمایشگاه های ژنتیکی صرف بهینه سازی  دستورالعمل های کیت استخراج DNA از بافت گیاه  و مطلوب سازی DNA استخراج شده ، نمایند .

از جمله مشکلات و موانعی که در استخراج DNA از بافت گیاه ، محقق و پژوهشگر را درگیر می کند ، استخراج و خالص سازی DNA با وزن مولکولی بالا در نمونه های گیاهی دارویی و یا نمونه های معطر می باشد که این مورد نیز گاهی منجر به کاهش میزان DNA  می شود که  این امر معمولا یا به دلیل وجود آنزیم های اندونوکلئاز و یا به دلیل  تخلیص شدن پلی ساکارید ها با ویسکوزیته ی بالا بطور همزمان در حین جداسازی DNA است . پلی ساکارید ها که همزمان با DNA استخراج می شوند ، به  دلیل ترکیبات خاص خود حالت چسبندگی به DNA می دهند که منجر به عدم کشیده شدن DNA با سمپلر می شود .

روند استخراج DNA از گیاه

همانطور که می دانید روند استخراج DNA  در چهار مرحله انجام می گیرد :

• در ابتدا با استفاده از شوک اسمزی و یا با استفاده از دترجنت هایی مانند تریتون ، یا تریس و EDTA ، با از بین بردن غشای سلولی و و دیواره ی هسته ، شکست سلولی رخ می دهد . البته به این نکته توجه کنید که استفاده از تریس برای ثابت نگه داشتن PH  می باشد .
• در مرحله بعدی با استفاده از دترجنت های یونی از قبیل SDS ( سدیم دودسیل سولفات ) ، اقدام به هضم پروتئین ها می شود . نقش سدیم دودسیل سولفات در این مرحله  تخریب و انهدام پروتئین های سلولی  و نیز پروتئین های متصل به DNA می باشد .
• سپس ته نشین کردن پروتئین ها انجام می گیرد که برای ته نشست آن ها از فنول و کلروفرم استفاده می شود .
• و در مرحله نهایی ته نشین کردن DNA انجام میگیرد که این مرحله با استفاده از اتانول مطلق انجام می گیرد .

در نهایت برای اندازه گیری پارامترهای کمیت و کیفیت DNA، محققان اغلب از نانودراپ استفاده می کنند، دستگاهی که می تواند به سرعت جذب DNA را با از دست دادن نمونه کمتر نسبت به طیف سنج های سنتی تعیین کند. به طور کلی، اگر نسبت های A260/A280 و A230/A280 حدود 1.9 باشد، DNA خالص تخمین زده می شود.

در حالی که روش‌های بسیار بیشتری برای استخراج DNA  وجود دارد،  اما گاهی اوقات استخراج با روش فنول-کلروفرم هنوز بهترین راه است.

استخراج DNA از گیاه با روش فنول- کلروفرم

برای استخراج DNA با استفاده از این روش، فنول-کلروفرم را با نسبت 1:1 تهیه و استفاده می کنیم. این مخلوط سپس سانتریفیوژ می شود. از آنجایی که مخلوط فنول: کلروفرم با آب غیر قابل اختلاط است، سانتریفیوژ باعث تشکیل دو فاز مجزا می شود: فاز آبی بالایی و فاز آلی پایین. فاز آبی به بالا می رود زیرا چگالی کمتری نسبت به فاز آلی حاوی فنول: کلروفرم دارد.

کلروفرم (CHCl3) یا تری کلرومتان یک حلال غیرقطبی (آبگریز) است که در آن پروتئین‌ها و لیپیدهای غیرقطبی حل می‌شوند تا تقسیم لیپیدها و بقایای سلولی را در فاز آلی تقویت کنند و DNA جدا شده را در فاز آبی محافظت کنند. کلروفرم جداسازی فاز دو مایع را تضمین می‌کند زیرا چگالی بالاتری دارد (1.47 گرم بر سانتی‌متر مکعب) و باعث جداسازی دقیق‌تر فازهای آلی و آبی می‌شود و در نتیجه به حذف فاز آبی با حداقل آلودگی متقاطع از فاز آلی کمک می‌کند.

کلروفرم به طور قابل توجهی چگال تر از آب است، بنابراین افزودن آن به فاز آلی، چگالی کلی آن فاز را افزایش می دهد و به جلوگیری از وارونگی فاز کمک می کند. به همین دلیل است که فنول، که فقط چگالی کمی بالاتر از آب دارد، باید با کلروفرم مخلوط شود تا مخلوطی با چگالی بسیار بالاتر از آب ایجاد شود.

علاوه بر این، کلروفرم به کاهش اینترفاز کمک می کند – مرز فازی بین دو فاز پر از مولکول هایی که نمی توانند تصمیم بگیرند به کجا می خواهند بروند. اینها می توانند پروتئین های تا حدی دناتوره شده، DNA (بسته به pH) و/یا پروتئین های دناتوره شده متصل شونده DNA  باشند که هنوز به DNA چسبیده اند، و این یک مشکل واقعی است. زیرا اگر هنگام برداشتن فاز آبی مقداری از این ماده را بردارید، خلوص نمونه خود را کاهش می دهید. اگر در حین جداکردن خیلی ترسو باشید، مقدار DNA حاصل از استخراج کاهش می یابد.بنابراین افزودن کلروفرم به مخلوط به کاهش این امر کمک می کند.

با افزودن کلروفرم ، لیپیدهای آبگریز به فاز آلی پایینی تقسیم می شوند و پروتئین ها در فاز بین دو فاز باقی می مانند، در حالی که اسیدهای نوکلئیک (و همچنین سایر آلاینده ها مانند نمک ها، قندها و غیره) در فاز آبی بالایی باقی می مانند. سپس فاز آبی بالایی را می توان با پیپت خارج کرد. باید مراقب بود تا از پیپت کردن هر یک از فازها یا مواد آلی در سطح مشترک جلوگیری شود. این روش اغلب چندین بار برای افزایش خلوص DNA انجام می شود. این روش DNA دو رشته ای بزرگی را به دست می دهد که می تواند در PCR یا RFLP استفاده شود.

در عصر امروز و با ارتقای علوم زیست مولکولی و نیاز بشر به مطالعات و بررسی های بیشتر در زمینه ی ژنتیک و بیوتکنولوژی و نیز بهبود فرآیند های ژنتیکی و زیست شناسی منجر به توجه بیشتر و اهمیت استفاده از  بهترین و کارآمد ترین دستورالعمل های استخراج DNA  شده است . از ملزومات و پیش نیاز همسان سازی و تکمیل کتابخانه های ژنومی در دنیا ، تخلیص و دستیابی به DNA با کیفیت و خلوص مطلوب است و محققان همیشه سعی بر آن داشته اند تا با به حداقل رساندن زمان و هزینه های گزاف ، دستورالعمل های موجود را به بهترین نحو تغییر داده و برای پیشبرد اهداف خود و حصول نتایج مطلوب استفاده کنند .

محصولات مرتبط :

کیت استخراج DNA  از خون | کیت استخراج DNA از بافت | پروتئیناز K |