گزارش کار استخراج DNA از خون + دانلود PDF گزارش کار

هدف از این آزمایش، استخراج DNA ژنومی با کیفیت و خلوص بالا از نمونه خون کامل انسان است. این DNA می‌تواند در تکنیک‌های مختلف زیست‌مولکولی نظیر PCR، تعیین توالی، کلونینگ، و آنالیزهای ژنتیکی به‌کار رود.

استفاده از کیت تجاری فیورژن FavorPrep این امکان را فراهم می‌کند تا با صرف زمان کوتاه، DNA به‌صورت خالص و آماده برای کاربردهای تحقیقاتی استخراج شود.

انتخاب روش مناسب برای استخراج DNA از خون کامل نه تنها بر کیفیت نتایج نهایی تأثیر می‌گذارد، بلکه بر کارایی و روانی فرآیندهای آزمایشگاهی در زیست‌شناسی مولکولی نیز نقش بسزایی دارد. به همین دلیل، برگزیدن تکنیک استخراج مناسب می‌تواند چالشی مهم به شمار رود.

← لینک دانلود انتهای مقاله

استخراج DNA ژنومی

در بسیاری از آزمایشگاه‌ها، یک پروتکل استاندارد یا ترجیحی برای جداسازی DNA وجود دارد. این تفاوت در پروتکل‌ها معمولاً به نحوه عملکرد مواد مورد استفاده در مراحل لیز سلولی و جداسازی انتخابی DNA برمی‌گردد.

به‌طور کلی، بیشتر روش‌های رایج برای استخراج DNA از خون کامل شامل چند مرحله پایه هستند که شامل تخریب غشای سلولی (لیز)، حذف پروتئین‌ها و سایر ناخالصی‌ها (از جمله RNA)، و در نهایت خالص‌سازی و بازیابی DNA می‌شود.

در میان روش‌های موجود، یکی از شیوه‌های رایج استفاده از تکنولوژی ستونی است. نمونه‌ای از این تکنیک‌ها، استخراج مبتنی بر سیلیکا است.

اساس عملکرد این فناوری بر پایه تمایل DNA به اتصال به سطح سیلیس در شرایط با غلظت بالای نمک بنا شده است که امکان جداسازی انتخابی و مؤثر DNA ژنومی را فراهم می‌کند

مواد و وسایل مورد نیاز برای استخراج DNA از خون

برای انجام این آزمایش، وسایل و مواد زیر مورد نیاز هستند:

1. 1. کیت استخراج DNA (فیورژن مدل FABGK 001) این کیت شامل ستون‌های سیلیکا، بافرها و آنزیم‌ها می باشد.
   2. نمونه خون کامل انسان (با EDTA یا هپارین)
   3. میکروتیوب‌های 1.5 میلی‌لیتری برای انجام مراحل مختلف
   4. سمپلر و نوک سمپلر برای انتقال دقیق مایعات
   5. اتانول ۹۶ تا ۱۰۰ درصد برای مراحل شستشو
   6. ورتکس برای مخلوط‌کردن محلول‌ها
   7. میکروسانتریفیوژ با توان حداقل ۱۸۰۰۰ × g
   8. وان حمام خشک یا آبی با قابلیت کنترل دما روی ۶۰ و ۶۵ درجه سانتی‌گراد
   9. بافر PBS برای رقیق‌سازی نمونه‌ها در صورت نیاز
   10. دستکش، روپوش آزمایشگاهی و عینک ایمنی برای رعایت اصول ایمنی

روش کار استخراج DNA از خون به روش ستونی:

قبل از شروع مراحل باید نمونه گیری یعنی خونگیری انجام شود.

معیارهای غیرقابل قبول بودن نمونه:

• اگر نمونه لخته باشد غیر قابل قبول است.
• اگر در ضد انعقادی بجز EDTA جمع آوری شده باشد، غیر قابل قبول است
• اگر حجم کمتر از 5ml غیر قابل قبول است.

نگهداری نمونه:

نمونه خون محیطی پیش از استخراج در صورت نگهداری در دمای اتاق 24 ساعت، تا 2 هفته در دمای 4ºc قابل نگهداری می باشد.

نمونه DNA ژنومی پس از پروسه استخراج DNA ،در باکس های مخصوص میکروتیوب 1.5ml، تا 1 سال در دمای 4ºc  و تا چندین سال در دمای 20ºc- قابل نگهداری می باشد.

پس از خونگیری برای استخراج DNA از خون کامل با استفاده از کیت ستونی( فیورژن FavorPrep ) مراحل زیر را انجام دهید:

1. مقدار ۲۰۰ میکرولیتر از نمونه خون کامل به درون یک میکروتیوب انتقال دهید. اگر حجم نمونه کمتر از ۲۰۰ میکرولیتر باشد، باید با استفاده از بافر PBS به این حجم رسانده شود.
2. در صورت نیاز به حذف RNA مقدار 4 میکرولیتر از RNase A با غلظت 100mg/ml به نمونه اضافه شود و به مدت ۲ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردد. این مرحله اختیاری است و در صورتی اجرا می‌شود که هدف استخراج DNA بدون RNA باشد
3. به نمونه خون، ۲۰ میکرولیتر از آنزیم Proteinase K و ۲۰۰ میکرولیتر از بافر لیزکننده FABG اضافه میکنیم. پس از آن، نمونه را با ورتکس  (Pulse Vortex) به‌خوبی مخلوط می کنیم. این مرحله برای تجزیه پروتئین‌ها و آزادسازی DNA از سلول‌ها بسیار حیاتی است.
4. مخلوط به دست آمده را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید. در این مدت، هر ۳ تا ۵ دقیقه، نمونه ورتکس شود تا کارایی لیز سلولی افزایش یابد.
5. سپس ۲۰۰ میکرولیتر اتانول ۹۶ درصد به نمونه اضافه میکنیم و مجدداً ورتکس می شود. اضافه‌کردن اتانول سبب تسهیل در اتصال DNA به ستون سیلیکا در مراحل بعدی می‌شود.
6. کل مخلوط را به ستون سیلیکا (FABG Mini Column) منتقل کرده و در ۶۰۰۰ × g به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ میکنیم. در این مرحله، DNA به ستون متصل می‌شود و سایر اجزای سلولی عبور می‌کنند.
7. برای حذف ناخالصی‌ها، ستون ابتدا با ۴۰۰ میکرولیتر از بافر W1 بشورید و سپس با ۷۵۰ میکرولیتر از بافر Wash شستشو داده شد. هر بار محلول عبوری پس از سانتریفیوژ دور ریخته شود. این مرحله برای حذف پروتئین، RNA و سایر آلودگی‌ها ضروری است.
8. ستون به مدت ۳ دقیقه دیگر با دور بالا سانتریفیوژ شود تا کاملاً خشک شود. خشک‌کردن کامل ستون باعث جلوگیری از باقی‌ماندن اتانول و تأثیر منفی آن بر واکنش‌های بعدی می‌شود.
9. ستون را به درون تیوب جمع‌آوری جدید منتقل کنید و ۱۰۰ میکرولیتر از بافر Elution گرم‌شده (در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد) به مرکز ستون اضافه کنید. پس از ۳ دقیقه، با یک مرحله سانتریفیوژ نهایی، DNA خالص به درون تیوب منتقل می شود.
10. نمونه DNA نهایی برای استفاده‌ های بعدی در دمای 20- برای مدت یک ماه و دمای 80- برای مدت طولانی قابل نگهداری است.

نتایج آزمایش 

نتایج حاصل از گزارش کار استخراج DNA از خون به شرح زیر است:

1. 1. • حجم نهاییElution : مقدار ۱۰۰میکرولیتر
      • مقدار کل DNA استخراج‌شده: تقریباً ۶.۵ میکروگرم
      • نسبت جذب نوری  260/280OD : مقدار ۱.۸۲ که نشان‌دهنده خلوص قابل قبول و نبود آلودگی است.
      • تصویر ژل آگارز (٪۱): باند واضح ژنومی بدون smear یا تخریب مشاهده می شود.

بحث و نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج به‌دست‌آمده، می‌توان نتیجه گرفت که کیت فیورژن FavorPrep عملکرد موفقی در استخراج DNA ژنومی با کیفیت بالا از نمونه خون دارد. مراحل انجام‌شده دقیقاً طبق پروتکل شرکت سازنده انجام شد و نتیجه نهایی نیز از نظر مقدار و خلوص DNA رضایت‌بخش بود.

وجود نسبت 260/280OD نزدیک به 1.8 نشان‌دهنده عدم حضور قابل توجه آلودگی‌هایی نظیر پروتئین یا فنول است. همچنین، وجود باند واضح DNA در ژل آگارز تأییدکننده کیفیت مطلوب نمونه استخراج‌شده می‌باشد.

این کیت قابلیت استخراج DNA مناسب برای کاربردهای حساس نظیر PCR و تعیین توالی را داراست و برای استفاده در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی توصیه می‌شود.

نکات ایمنی و ملاحظات

1. 1. • تمامی مراحل باید در شرایط ایمن و با استفاده از تجهیزات محافظتی انجام شود.
      • بافرهای مورد استفاده ممکن است محرک باشند؛ از تماس مستقیم با پوست و چشم پرهیز شود.
      • لطفا اطمینان حاصل کنید که در اولین استفاده، اتانول به بافرهای W1 و Wash به میزان صحیح اضافه شده باشد.
      • نمونه خون باید تازه یا به‌درستی فریز شده باشد تا از تخریب DNA جلوگیری شود.
      • مراحل سانتریفیوژ و خشک‌سازی ستون باید با دقت بالا انجام شود تا خلوص نهایی تحت تأثیر قرار نگیرد.

دانلود PDF  گزارش کار استخراج DNA از خون (دستورالعمل)