کاربرد مسترمیکس سایبرگرین در بررسی های مولکولی و روش سایبرگرین
پیشرفت های اخیر در زمينه ی سیستم های انتقال انرژی فلورسانس این امکان را فراهم ساخته است که سنجش کمّی محصولات تولید شده به طورهمزمان با تکثیر قطعات انجام شود. در این سیستم ها از اولیگونوکلئوتید های اختصاصی توالی ها، برای تشخیص محصولات استفاده می شود که در هر سیکل از واکنش PCRقادر به اندازه گیری میزان تابش فلورسانس درهر نمونه می باشد و به همین دلیل، تشخیص دقیق توالی هدف، همزمان با افزایش مقدار آن يا در حين واكنش امکان پذیر می باشد. اين پيشرفت ها منجر به معرفي روش پیشرفته تری به نام ریل تایم (Real-Time PCR ) گرديده است. مفهوم ریل تایم پی سی آر ، مشاهده ی لحظه به لحظه ی فرآیند PCR است.
فرآیند ریل تایم ( Real-Time PCR )
ریل تایم یا PCR کمی ( qPCR ) و یا “واکنش زنجیر های پلیمراز کینتیک” نیز می شناسند، دارای كاربردهاي گسترده ای در آزمایش های پزشکی و تحقیقاتی برای تشخیص و اندازه گیری کمّیت توالی های اختصاصی RNA و DNA می باشد. در این روش، از رنگ ها و پروب های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس استفاده می شود. در طی انجام واکنش PCR، ماده ی فلورسانسی که در هر سیکل از واکنش آزاد می شود توسط یک دستگاه Detector شناسایی و ثبت می گردد که این میزان از ماده فلورسانس متناسب با مقدار محصولات تولید شده در هر سیکل می باشد. بنابراين ميزان فلورسانس، نشانگر محصول و تكثير DNA است. به این معنی که در زمان واقعی، تولید محصول توسط دستگاه Detector گزارش داده می شود. در حالی که در روش های PCR کمّی معمولی، تولید محصول فقط در پایان کار تشخیص داده می شود. اساس این روش، ارتباط کمی بین مقدار مواد هدف موجود قبل از PCR و مقدار محصول تولید شده در طی فرآیند PCR است.
رنگ فلورسانس در روش ریل تایم
در روش ریل تایم پی سی آر ، از رنگ های فلورسانسی، مانند سایبرگرین و یا پروب هایی (شاخص های الیگو نوکلئوتیدی) که به رنگ های فلورسانس متصل می شوند، برای آشكارسازي و اندازه گيري کردن روند همانندسازي DNA استفاده می شود، که از مقدار انتشار نور فلورسانس آن ها، می توان به ميزان محصولات پی برد. از رنگ های فلورسانس خاصی که می توانند به DNA دو رشته ای متصل شوند مانند سایبرگرین جهت ریل تایم پی سی آر (Real-Time PCR ) بهره برداری می شود. این رنگ ها پس از اتصال به DNA ، فلورسانس از خود ساطع می کنند. به عبارتی در طی واکنش PCR ، و با افزایش میزان DNA دورشته ای، میزان نور فلورسانس منتشر شده افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل از PCR ، یک منحنی حاصل می شود که با کمک نمودار استاندارد می توان غلظت DNA هدف را سنجید. از متداول ترین رنگ های فلورسانس جهت استفاده در Real-Time PCR ، می توان به سایبرگرین اشاره کرد.
رنگ سایبرگرین
رنگ سایبرگرین، یک رنگ سیانیدی می باشد که در رنگ آمیزی اسید های نوکلئیک، در بیولوژی مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد. سایبرگرین ترجیحاً به شیار کوچک DNA دورشته ای متصل می شود و البته با میل ترکیبی کمتری بهDNA تک رشته ای وRNA نیزمتصل می شود و پس از اتصال، میزان تشعشع نور فلورسانس آن افزایش می یابد. سایبرگرین نسبت به اتیدیوم بروماید اثرات جهش زایی کمتری دارد اما به دلیل قدرت نفوذ بیشتر آن در سلو ل های زنده، اثرات سمّیت آن بیشتر است.
نحوه ی عملکرد مسترمیکس سایبرگرین در Real-Time PCR :
- به محض اضافه کردن مسترمیکس سایبرگرین به نمونه ، بلافاصله به تمام مولکو ل های DNA دورشته ای موجود در نمونه متصل می شود.
- در طی PCR، آنزیم پلیمراز، توالی های هدف را تکثیر می کند و آمپلیکو ن ها یا قطعات تکثیر شده تولید می شوند.
- در این مرحله، سایبرگرین به هر کدام از کپی های DNA دو رشته ای که تازه تکثیر شده است اتصال پیدا می کند.
- درنهایت به دلیل اتصال سایبرگرین به مولکول های DNA دو رشته ای که طی واکنشPCR با تولید آمپلیکون های جدید رخ می دهد، شدت نورفلورسانس به نسبت میزان تکثیر آمپلیکون ها افزایش پیدا می کند. بیشترین میزان فلورسانس در پایان مرحله ی پلی مریزه شدن اتفاق می افتد و کمترین مقدار آن در مرحله ی دناتوره شدن DNA رخ می دهد.
مسترمیکس سایبرگرین (SYBR Green qPCR mastermix) شرکت یکتاتجهیزآزما، با عملکرد و کارایی بالایی که دارد برای روش Real-Time PCR به طور اختصاصی طراحی و ارائه شده است. مسترمیکس سایبرگرین یکتا تجهیز آزما، از بهترین کمپانی اروپایی تهیه گردیده و حاوی آنزیم Hot start می باشد.
آنزیم هات استارت | Hotstart
آنزیم هات استارت استفاده شده در مسترمیکس سایبرگرین یکتا تجهیز آزما، از نوع آنتی بادی می باشد. این محصول سازگاری کاملی با انواع دستگاه های ریل تایم مثل (لایت سایکلر)Light Cycler ، (روتور ژن) Rotor-Gene و دستگاه ABI دارد. درصورت استفاده از دستگاه ABI ، در زمان آماده سازی واکنش، طبق دستورالعمل مندرج شده، DYE اضافه می شود که این محصول نیز توسط شرکت یکتا تجهیز آزما ارائه می گردد.
