همه چیز درمورد روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)

روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) یا qPCR

چنانچه از مفهوم کلمه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) استنباط میشود، درواقع مانیتوریگ لحظه به لحظه یک پروسه میباشد.از جمله عوامل موثر در بوجود آمدن روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) ،مشکلات و نقص های متعدد در PCR معمولی و نیز احساس نیاز به یک روند دقیق تر برای تعیین کمی آن بود.

Real-Time PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی، یکی از پیشرفته‌ترین و دقیق‌ترین تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی است که برای تکثیر و هم‌زمان اندازه‌گیری کمی DNA به کار می‌رود. این روش qPCR (Quantitative PCR) نیز نامیده می‌شود، در بسیاری از حوزه‌های علمی از جمله پزشکی، ژنتیک و زیست‌فناوری جایگاه ویژه‌ای دارد.

تفاوت Real-Time PCR با PCR معمولی

در حالی که PCR معمولی تنها برای تکثیر DNA به کار می‌رود، Real-Time PCR به محققان این امکان را می‌دهد که مقدار DNA تکثیرشده را به صورت هم‌زمان (در زمان واقعی) اندازه‌گیری کنند.

تفاوت‌های کلیدی عبارتند از:

1. اندازه‌گیری کمی:
   • در PCR معمولی، نتایج در پایان واکنش با استفاده از ژل الکتروفورز بررسی می‌شوند.
   • در Real-Time PCR، تغییرات میزان DNA در هر چرخه اندازه‌گیری می‌شود.
2. حساسیت بالا:
   Real-Time PCR امکان تشخیص دقیق و حساس DNA را حتی در مقادیر بسیار کم فراهم می‌کند.
3. زمان کمتر:
   نیازی به فرآیندهای پس از واکنش مانند الکتروفورز نیست.

مبانی روش Real-Time PCR

Real-Time PCR از ترکیب سه مرحله اصلی PCR (دناتوراسیون، اتصال پرایمرها، و تکثیر) استفاده می‌کند، اما با یک تفاوت عمده: استفاده از رنگ‌های فلورسنت برای نظارت بر تکثیر DNA در زمان واقعی.

مراحل اصلی:

1. دناتوراسیون (Denaturation): DNA دو رشته‌ای با حرارت بالا جدا می‌شود.
2. اتصال پرایمرها (Annealing): پرایمرها به توالی هدف متصل می‌شوند.
3. تکثیر (Extension): آنزیم پلیمراز DNA جدید را سنتز می‌کند.

در هر چرخه، سیگنال فلورسنت افزایش می‌یابد که با مقدار DNA تکثیرشده رابطه مستقیم دارد.

ابزارهای کلیدی در Real-Time PCR

1. رنگ‌های فلورسنت:
   • SYBR Green : به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شود و نور فلورسنت تولید می‌کند.
   • پروب‌های TaqMan: شامل توالی‌های اختصاصی هستند که سیگنال فلورسنت تولید می‌کنند.
2. دستگاه Real-Time PCR:
   دستگاهی که می‌تواند تغییرات فلورسنت را در هر چرخه اندازه‌گیری کند.
3. آنزیم پلیمراز مقاوم به دما:
   اغلب از Taq Polymerase استفاده می‌شود که قابلیت عملکرد در دماهای بالا را دارد.

انواع روش‌های Real-Time PCR

1. روش با استفاده از SYBR Green:
   • این روش ارزان‌تر و ساده‌تر است، اما اختصاصیت کمتری دارد.
2. روش با استفاده از پروب‌های TaqMan:
   • این روش اختصاصیت بالایی دارد و برای تحقیقات حساس و تشخیص بیماری‌ها مناسب است.

مزایای روش ریل تایم (Real time PCR)

• امکان رویت لحظه به لحظه یک واکنش مهیا است و در هر دوره ( سیکل) ، کاربر میتواند پروسه تکثیر را بررسی کند. به عبارت دیگر و بطور خلاصه تکثیر در هر زمان قابل رویت و بررسی است.
• امکان شرایط ارتقا واکنش با مناسبترین غلظت DNA ، پرایمر و تعداد سیکل ها (دوره ها) برای تکثیر امکان پذیر است.
• در هر زمان که کاربر تشخیص دهد میتواند برای جلوگیری از اتلاف وقت و انرژی ، واکنش را پایان دهد چراکه روند PCR قابل رویت و بررسی است و عدم تکثیر و رفتن به حالت سکون کاملا مشخص است.
• میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه قابل شناسایی است.
• واکنش ها سریع تر و در زمان کوتاه تری انجام میشود.
• محدوده تشخیص آن بیشتر از PCR معمولی است بطوریکه اختلاف کمتر از 2 برابر هم نشان میدهد.

توضیحات تکمیلی روش ریل تایم پی سی آر

دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)  با هدف تعیین میزان بیان ژن های موجودات زنده راه اندازی و ارتقا داده شده است. روش پی سی آر (PCR) ساده دارای نقص و محدودیت هایی از قبیل عدم توانایی مطالعه ی کمی میزان بیان یک ژن میباشد.

بنابراین سیستمی توسعه یافته با عنوان ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) ارائه شده است که هدف اصلی از این سیستم نشان گذاری ژن های موجودات زنده می باشد که مسیر کل مجموعه ژنومی منتهی به  ساخت محصولاتی از جنس RNA و پروتئین  میشود. در واقع  RNA یا ریبونوکلویک اسید های یک سلول می تواند قادر به تعیین خصوصیت و وجه تمایز یک سلول در سطح فنوتیپی دارد و نیز نشان میدهد در چه سطحی آن خصوصیت را بروز می دهد  .

از طرفی به جهت اینکه DNA همیشه ثابت بوده و یک ژن مشخص در بین موجودات یک گونه شباهت بسیاری به هم دارد و هیچ نشانه ای از میزان بیان آن ژن ارائه نمی دهد عمل مقایسه دو سلول از نظر خصوصیات و فنوتیپی را نمی توان در سطح DNA بررسی نمود،.بنابراین مطالعه ی بیان یک ژن می تواند در سطح RNA و یا پروتئین انجام پذیرد. همچنین بسیاری از ژن ها در نهایت به RNA تبدیل شده و نقششان را باعنوان RNA به انجام می رسانند. در نتیجه در برخی موارد محصول ژنی به شکل RNA عرضه شده و هیچ گاه قرار نیست به پروتئین ترجمه شود. در اینصورت برای بیان آن ژن مشخص که فقط رونویسی می شود ولی ترجمه نمی شود، فقط RNA مورد بررسی می باشد.

مولکول RNA یا ریبونوکلویک اسید به دلیل داشتن اکسیژن در کربن شماره 2 و همچنین تک رشته و کوتاه بودن آن، نسبت به مولکول های DNA واکنش پذیر تر بوده و تخریب پذیری بالایی دارد.

کاربرد Real time PCR :

این روش هم در زمینه تحقیقاتی هم در زمینه بالینی و تشخیص بیماری ها به کار برده می شود که کاربرد Real time PCR  در حوزه بالینی به طور قابل توجهی افزایش یافته است. به عنوان مثال ، این روش در زمینه میکروبیولوژی بالینی، انکولوژی و ژن درمانی به یک روش استاندارد برای تشخیص بیماری تبدیل شده است. هنگام کار با نمونه‌های بالینی، عوامل خاصی باید در نظر گرفته شوند، که برای تحقیقات مولکولی اعمال نمی‌شوند. استانداردسازی آزمون در آزمایشگاه های مختلف از اهمیت زیادی برخوردار است. همچنین  استفاده ازکنترل های مثبت و منفی مرتبط باید در تمام سنجش ها گنجانده شوند. علاوه بر این، کیفیت بهینه RNA برای به دست آوردن نتایج کمی قابل اعتماد از اهمیت بالایی برخوردار است.

بیان ژن در ریل تایم پی سی آر ( ریل تایم PCR):

در ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) جهت بررسی بیان یک ژن، ابتدا با کمک آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (آنزیم MMLV)  مولکول های RNA را سنتز و به DNA های مکمل که غالبا cDNA نامیده می شوند، تبدیل میکنند. پس از پایداری مولکول مورد سنجش، وارد سیکل های ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) شده و بیان مورد مطالعه قرار می گیرد.

دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) از یک سیستم اپتیکی بهره برده که توسط آن میزان DNA هر نمونه محاسبه می گردد. زمانی که cDNA سنتز شد، پس از آماده سازی نمونه جهت ورود به سیکل های پلیمریزه شدن، به نمونه DNA رنگی تحت عنوان سایبرگرین (SYBR Green) اضافه می گردد.

این محصول موجب رنگ شدن DNA شده و همچنین خود دارای ویژگی فلورسانتی می باشد. زمانی که ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) سیکل های پلیمریزاسیون خود را شروع کرد، به ازای ساخته شدن رشته های DNA جدید، رنگ سایبر گرین به رشته متصل می شود و دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) توسط فناوری منحصربه فرد خود خوانش فلورسانتی را شروع می کند.

لذا روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) با ویژگی فلورسنتی سایبر گرین (SYBR Green) برای هر نمونه یک گراف تکثیر ترسیم می کند. هر نقطه از گراف تکثیر نشان دهنده میزان اتصال SYBR Green به رشته DNA می باشد و در نهایت گراف که در نمایشگر متصل شده به ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)  به نمایش در آمده، به آستانه خود می رسد. این میزان نشان دهنده میزان DNA بیان شده در هر نمونه می باشد.

عملکرد سایبرگرین چیست؟

سایبرگرین (SYBR Green) رنگی است که با قرار گرفتن بین پایه های DNA به مولکولهای دو رشته ای DNA متصل میشود.

این رنگ یکی از مواد تشکیل دهنده مسترمیکس سایبرگرین برای استفاده در دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) میباشد زیرا با وجود این ماده دستگاه ریل تایم میتواند در انتهای هر چرخه توالی ، مقدار امپلیفای (amplify) شدن DNA را اندازه بگیرد.

چرا سایبرگرین به DNA  اتصال پیدا میکند؟

هنگامی که محقق از مسترمیکس سایبرگرین استفاده میکند ، بعد از اتصال پرایمرها ، چند مولکول رنگ به رشته دوتایی DNA متصل میشود. اتصال به DNA  منجر به افزایش چشمگیر مولکول های سایبرگرین جهت انتشار نور میشود. در مرحله طویل شدن DNA تعداد مولکولهای سایبرگرین بیشتری به DNA  سنتز شده جدید متصل میشود.

حساسیت رنگ سایبرگرین موجود در مسترمیکس به نور چگونه است؟

رنگ سایبرگرین موجود در مسترمیکس ریل تایم حساسیت کمی به نور دارد بطوری که هر زمانی که برای کاربر امکان پذیر است باید از نور محافظت شود.

آیا رنگ سایبرگرین بی خطر است ؟

با توجه به تحقیقات به عمل آمده ،سایبرگرین نوعی رنگ سیانین است که در تحقیقات زیست شناسی مولکولی استفاده می شود و بی خطر بودن آن کاملا اثبات شده است.

مواد تشکیل دهنده مسترمیکس سایبرگرین چیست؟

غلظت این محصول یکتاتجهیزآزما 2x میباشد و حاوی KCl،  dNTP ، MgCl2، هات استارت تک (hotstart taq DNA polymerase) ، رنگ سایبرگرین و بافر بهینه شده می باشد.

‍‍‍