ارتباط مستقیم با کارشناس فروش
استخراج پلاسمید با کیت به روش Giga prep و Mini prep
پلاسمیدها (Plasmids) مولکول‌های DNA حلقوی و دو رشته‌ای هستند که به طور طبیعی در بسیاری از باکتری‌ها و برخی موجودات یوکاریوتی وجود دارند. این عناصر ژنتیکی به‌عنوان ناقل (Vector) در مهندسی ژنتیک، کلونینگ، بیان ژن، تولید پروتئین‌های نوترکیب و حتی در ساخت واکسن‌های DNA مورد استفاده قرار می‌گیرند. برای انجام این کاربردها، استخراج پلاسمید از سلول‌های میزبان یک مرحله حیاتی محسوب می‌شود.
استخراج پلاسمید با کیت به روش‌های Mega و Giga Prep
روش‌های استخراج پلاسمید بر اساس میزان مورد نیاز DNA و مقیاس کار به دسته‌های مختلف تقسیم می شوند:
Mini prep ، Midi prep، Maxi prep، Mega prep و Giga prep
روش استخراج Mini prep برای بررسی سریع کیفیت کلونینگ و غربالگری کلنی‌ها کاربرد دارداما روش های Mega و Giga prep برای زمانی استفاده می‌شوند که به مقدار بسیار زیادی پلاسمید DNA با خلوص بالا نیاز است.
plasmid-DNA-extraction-mini-kit.
کیت استخراج پلاسمید مینی Mini prep favorgen
چرا از روش استخراج پلاسمید Mega و Giga Prep استفاده کنیم؟
در تحقیقات پایه و آزمایشگاه‌های آموزشی، معمولاً تولید چند میکروگرم DNA کافی است. اما در پروژه‌های پیشرفته‌تر، نیاز به میلی‌گرم‌های زیادی از پلاسمید خالص وجود دارد. به‌ویژه در موارد زیر:
- ترانسفکشن در مقیاس بزرگ (Large-scale transfection) در سلول‌های یوکاریوتی.
- بیان پروتئین نوترکیب در سیستم‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی.
- ساخت واکسن‌های DNA یا ژن‌درمانی (Gene Therapy)
- کاربردهای صنعتی در تولید داروها و آنزیم‌ها
روش‌های Mega prep و Giga prep طراحی شده‌اند تا حجم زیادی از کشت باکتری را پردازش کرده و چندین میلی‌گرم DNA خالص و پایدار تولید کنند. به این دلیل از روش های Mega prep و Giga prep استفاده می شود.
مقایسه بین انواع روش‌های استخراج پلاسمید
| روش | حجم کشت باکتری | میزان تقریبی DNA | کاربرد |
|---|---|---|---|
| Mini prep | 1–5 mL | 20–50 µg | بررسی سریع کلونینگ، PCR |
| Midi prep | 25–50 mL | 100–300 µg | آنالیز توالی، آزمایش‌های کوچک |
| Maxi prep | 100–250 mL | 500 µg – 2 mg | کلونینگ پیشرفته، بیان ژن |
| Mega prep | 250–500 mL | 2–5 mg | ترانسفکشن گسترده، بیان پروتئین |
| Giga prep | 1–2.5 L | 7–10 mg (گاهی بیشتر) | واکسن DNA، ژن‌درمانی، تولید صنعتی |
مراحل استخراج پلاسمید به روش Mega و Giga Prep
کشت باکتری (Bacterial culture)
- از سویه‌های استاندارد E. coli مانند DH5α، JM109 یا XL1-Blue استفاده می‌شود.
- حجم کشت بسته به نوع روش بین 250 mL (برای Mega) تا 2.5 L (برای Giga) متغیر است.
- محیط‌های غنی مانند Terrific Broth (TB) یا 2xYT برای افزایش بازده توصیه می‌شوند.
برداشت سلول‌ها (Harvesting)
- با سانتریفیوژ دور بالا (6000–8000 g) سلول‌ها رسوب داده می‌شوند.
- در مقیاس Giga prep این مرحله به دستگاه‌های سانتریفیوژ صنعتی نیاز دارد.
لیز قلیایی (Alkaline lysis)
- بافر لیز شامل SDS و NaOH برای شکستن غشا و دناتوره کردن DNA استفاده می‌شود.
- سپس بافر خنثی‌سازی (Potassium acetate یا Sodium acetate) اضافه می‌شود تا DNA ژنومی و پروتئین‌ها رسوب کنند و پلاسمید در سوپرناتانت باقی بماند.
فیلتراسیون یا سانتریفیوژ
- سوپرناتانت شفاف‌سازی می‌شود تا بقایای سلولی حذف گردد.
- اتصال پلاسمید به ستون سیلیکا (Binding to silica column)
- محلول حاوی پلاسمید به ستون‌های سیلیکا یا رزین‌های اختصاصی منتقل می‌شود.
- DNA در حضور نمک‌های chaotropic به ستون متصل می‌شود.
شستشو (Wash)
- ستون با محلول‌های حاوی اتانول شستشو داده می‌شود تا پروتئین‌ها و نمک‌ها حذف شوند.
الیوشن (Elution)
- پلاسمید DNA با آب بدون نوکلئاز یا بافر TE (Tris-EDTA) بازیابی می‌شود.
- در کیت‌های Endotoxin-free مرحله اضافی برای حذف لیپوپلی‌ساکاریدهای باکتریایی وجود دارد که برای ترانسفکشن در سلول‌های پستانداران یا تزریق در حیوانات حیاتی است.
بیشتر بخوانید علائم انفولانزا
مزایا و محدودیت‌های روش استخراج پلاسمید با کیت به روش گیگا و مگا
مزایای روش giga و mega
- تولید مقادیر بسیار زیاد DNA پلاسمیدی.
- خلوص بالا، قابل استفاده در سلول‌های حساس یوکاریوتی.
- امکان انتخاب کیت‌های Endotoxin-free برای کاربردهای in vivo.
محدودیت‌های روش giga و mega
- نیاز به حجم زیاد محیط کشت و مواد مصرفی.
- وابسته به دستگاه‌های سانتریفیوژ پرقدرت.
- هزینه‌بر بودن نسبت به Mini و Maxi prep
- زمان‌برتر (به دلیل مراحل حجیم‌تر).
نتیجه‌گیری
روش‌های Mega و Giga prep ابزار قدرتمندی برای استخراج پلاسمید در مقیاس بزرگ هستند. در حالی که Mega prep بیشتر برای کاربردهای تحقیقاتی پیشرفته و آزمایش‌های بیان ژن یا ترانسفکشن‌های گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد، Giga prep برای کاربردهای صنعتی و درمانی همچون واکسن DNA یا ژن‌درمانی طراحی شده است.
انتخاب بین این روش‌ها به حجم کار، هدف نهایی، و نیاز به خلوص و مقدار DNA بستگی دارد. در نهایت، این تکنیک‌ها بخش مهمی از مسیر انتقال از تحقیقات آزمایشگاهی به کاربردهای بالینی و صنعتی را تشکیل می‌دهند.
