استخراج پلاسمید با کیت به روش Giga prep و Mini prep

پلاسمیدها (Plasmids) مولکول‌های DNA حلقوی و دو رشته‌ای هستند که به طور طبیعی در بسیاری از باکتری‌ها و برخی موجودات یوکاریوتی وجود دارند. این عناصر ژنتیکی به‌عنوان ناقل (Vector) در مهندسی ژنتیک، کلونینگ، بیان ژن، تولید پروتئین‌های نوترکیب و حتی در ساخت واکسن‌های DNA مورد استفاده قرار می‌گیرند. برای انجام این کاربردها، استخراج پلاسمید از سلول‌های میزبان یک مرحله حیاتی محسوب می‌شود.

استخراج پلاسمید با کیت به روش‌های Mega و Giga Prep

روش‌های استخراج پلاسمید بر اساس میزان مورد نیاز DNA و مقیاس کار به دسته‌های مختلف تقسیم می شوند:

 Mini prep ، Midi prep، Maxi prep،  Mega prep و Giga prep

روش استخراج Mini prep برای بررسی سریع کیفیت کلونینگ و غربالگری کلنی‌ها کاربرد دارداما روش‌ های Mega و Giga prep برای زمانی استفاده می‌شوند که به مقدار بسیار زیادی پلاسمید DNA با خلوص بالا نیاز است.

plasmid-DNA-extraction-mini-kit.

کیت استخراج پلاسمید مینی Mini prep favorgen

 

 

چرا از روش استخراج پلاسمید Mega و Giga Prep استفاده کنیم؟

در تحقیقات پایه و آزمایشگاه‌های آموزشی، معمولاً تولید چند میکروگرم DNA کافی است. اما در پروژه‌های پیشرفته‌تر، نیاز به میلی‌گرم‌های زیادی از پلاسمید خالص وجود دارد. به‌ویژه در موارد زیر:

• ترانسفکشن در مقیاس بزرگ (Large-scale transfection)  در سلول‌های یوکاریوتی.
• بیان پروتئین نوترکیب در سیستم‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی.
• ساخت واکسن‌های DNA یا ژن‌درمانی (Gene Therapy)
• کاربردهای صنعتی در تولید داروها و آنزیم‌ها

روش‌های Mega prep و Giga prep طراحی شده‌اند تا حجم زیادی از کشت باکتری را پردازش کرده و چندین میلی‌گرم DNA خالص و پایدار تولید کنند. به این دلیل از روش های Mega prep و Giga prep استفاده می شود.

مقایسه بین انواع روش‌های استخراج پلاسمید

مراحل استخراج پلاسمید به روش Mega و Giga Prep

1. کشت باکتری (Bacterial culture)

• از سویه‌های استاندارد E. coli مانند DH5α، JM109 یا XL1-Blue استفاده می‌شود.
• حجم کشت بسته به نوع روش بین 250 mL (برای Mega) تا 2.5 L (برای Giga) متغیر است.
• محیط‌های غنی مانند Terrific Broth (TB) یا 2xYT برای افزایش بازده توصیه می‌شوند.

2. برداشت سلول‌ها (Harvesting)

• با سانتریفیوژ دور بالا (6000–8000 g) سلول‌ها رسوب داده می‌شوند.
• در مقیاس Giga prep این مرحله به دستگاه‌های سانتریفیوژ صنعتی نیاز دارد.

3. لیز قلیایی (Alkaline lysis)

• بافر لیز شامل SDS و NaOH برای شکستن غشا و دناتوره کردن DNA استفاده می‌شود.
• سپس بافر خنثی‌سازی (Potassium acetate یا Sodium acetate) اضافه می‌شود تا DNA ژنومی و پروتئین‌ها رسوب کنند و پلاسمید در سوپرناتانت باقی بماند.

4. فیلتراسیون یا سانتریفیوژ

• سوپرناتانت شفاف‌سازی می‌شود تا بقایای سلولی حذف گردد.

5. اتصال پلاسمید به ستون سیلیکا (Binding to silica column)

• محلول حاوی پلاسمید به ستون‌های سیلیکا یا رزین‌های اختصاصی منتقل می‌شود.
• DNA در حضور نمک‌های chaotropic به ستون متصل می‌شود.

6. شستشو (Wash)

• ستون با محلول‌های حاوی اتانول شستشو داده می‌شود تا پروتئین‌ها و نمک‌ها حذف شوند.

7. الیوشن (Elution)

• پلاسمید DNA با آب بدون نوکلئاز یا بافر  TE (Tris-EDTA) بازیابی می‌شود.
• در کیت‌های Endotoxin-free مرحله اضافی برای حذف لیپوپلی‌ساکاریدهای باکتریایی وجود دارد که برای ترانسفکشن در سلول‌های پستانداران یا تزریق در حیوانات حیاتی است.

بیشتر بخوانید علائم انفولانزا

مزایا و محدودیت‌های روش استخراج پلاسمید با کیت به روش گیگا و مگا

مزایای روش giga  و mega

• تولید مقادیر بسیار زیاد DNA پلاسمیدی.
• خلوص بالا، قابل استفاده در سلول‌های حساس یوکاریوتی.
• امکان انتخاب کیت‌های Endotoxin-free برای کاربردهای in vivo.

محدودیت‌های روش giga  و mega

• نیاز به حجم زیاد محیط کشت و مواد مصرفی.
• وابسته به دستگاه‌های سانتریفیوژ پرقدرت.
• هزینه‌بر بودن نسبت به Mini و Maxi prep
• زمان‌برتر (به دلیل مراحل حجیم‌تر).

نتیجه‌گیری

روش‌های Mega و Giga prep ابزار قدرتمندی برای استخراج پلاسمید در مقیاس بزرگ هستند. در حالی که Mega prep بیشتر برای کاربردهای تحقیقاتی پیشرفته و آزمایش‌های بیان ژن یا ترانسفکشن‌های گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد، Giga prep برای کاربردهای صنعتی و درمانی همچون واکسن DNA یا ژن‌درمانی طراحی شده است.

انتخاب بین این روش‌ها به حجم کار، هدف نهایی، و نیاز به خلوص و مقدار DNA بستگی دارد. در نهایت، این تکنیک‌ها بخش مهمی از مسیر انتقال از تحقیقات آزمایشگاهی به کاربردهای بالینی و صنعتی را تشکیل می‌دهند.