Real-Time PCR  با استفاده از رنگ SYBR Green یکی از روش‌های پرکاربرد برای شناسایی و اندازه‌گیری کمی اسیدهای نوکلئیک است. شرکت یکتاتجهیزآزما مسترمیکس Smart SYBR Green qPCR mastermix  را با تکنولوژی پرایمر بلاک و کاهش حداکثری پرایمر دایمر تولید کرده است که با قیمت رقابتی در دسترس میباشد.

خرید مستر میکس ریل تایم سایبرگرین از یکتاتجهیز آزما

 

مزایای مستر میکس ریل تایم اسمارت سایبرگرین نسبت به مستر میکس سایبرگرین

1. تکنولوژی پیشرفته بلوکه‌سازی پرایمرها (Primer Block Technology)  

اسمارت گرین با استفاده از یک پروتئین متصل‌شونده به پرایمر، از آغاز واکنش قبل از شروع فرآیند جلوگیری می‌کند. این ویژگی موجب افزایش اختصاصیت و کارایی واکنش می‌شود.

خرید مسترمیکس ریل تایم اسمارت سایبرگرین از یکتا تجهیز

2. فرمولاسیون بهینه‌شده برای حساسیت بالا

این مستر میکس با بهره‌گیری از بافر بهینه‌شده و آنزیم‌های مهندسی‌شده، حساسیت و دقت بالاتری در اندازه‌گیری بیان ژن‌ها ارائه می‌دهد.

با وجود حساسیت بالا، این روش نسبت به عوامل متعددی آسیب‌پذیر است که می‌توانند منجر به نتایج منفی کاذب یا کاهش حساسیت شوند. این مقاله به‌صورت جامع عوامل مؤثر بر بروز نتایج منفی را در سه حوزه اصلی نمونه، طراحی واکنش و شرایط دستگاه بررسی می‌کند.

1. مقدمه

SYBR Green به‌عنوان یک رنگ بین‌یابنده DNA دو رشته‌ای (dsDNA intercalating dye) به هر محصول PCR اعم از هدف و غیرهدف متصل می‌شود و افزایش فلورسانس متناسب با میزان محصول تکثیر شده است. حساسیت بالای این روش مزیت مهم آن است، اما هرگونه افت کیفیت در نمونه، طراحی نامناسب پرایمر، یا شرایط غیربهینه واکنش می‌تواند باعث شکست در شناسایی هدف و ایجاد نتیجه منفی شود.

2.عوامل مرتبط با کیفیت نمونه

2-1 .غلظت و تمامیت نوکلئیک‌اسید

• DNA یا RNA با غلظت پایین ممکن است تا انتهای چرخه‌های PCR به حد تشخیص نرسد.
• تجزیه نوکلئیک‌اسید به‌علت نگهداری طولانی‌مدت، چندین بار فریز و ذوب، یا تماس با RNase/DNase باعث کاهش طول قطعات قابل تکثیر می‌شود.

2-2 . اثر نمونه‌های کهنه بر کارایی واکنش

نمونه‌های قدیمی می‌توانند به شکل قابل توجهی کارایی تست Real-Time PCR با SYBR Green را کاهش دهند. سه مکانیسم اصلی در این زمینه دخیل هستند:

1. تجزیه اسید نوکلئیک:
   در نمونه‌های قدیمی، به‌ویژه اگر در شرایط دمایی نامناسب یا بدون محافظت آنزیمی نگهداری شده باشند، DNA یا RNA به مرور زمان تخریب شده و قطعات کوتاه و ناقص تولید می‌شود که یا تکثیر نمی‌شوند یا راندمان تکثیرشان پایین است. در تست‌های RNA (مانند RT-qPCR) این مشکل شدیدتر است، زیرا RNA بسیار ناپایدارتر است.
2. آلودگی‌های مهارکننده (PCR Inhibitors):
   با گذر زمان، محصولات تجزیه سلولی یا رشد میکروبی می‌توانند وارد نمونه شوند و فعالیت Taq DNA polymerase را مهار کنند.
3. افزایش نویز در سیگنال SYBR Green:
   قطعات DNA غیرهدف یا تجزیه‌شده قادر به ایجاد اتصال غیراختصاصی SYBR Green هستند و این امر باعث تغییر در منحنی ذوب (melting curve) و افزایش احتمالfalse positive  یا کاهش شدت سیگنال می‌شود.

به طور کلی، استفاده از نمونه‌های تازه و نگهداری صحیح آن‌ها )دمای مناسب، جلوگیری از چرخه‌های مکرر فریز/ذوب و حضور مهارکننده  ( RNase/DNase برای بهبود حساسیت و اختصاصیت توصیه می‌شود.

  .2-3  وجود مهارکننده‌های PCR

• ترکیباتی مانند پروتئین‌ها، فنل، اتانول باقی‌مانده از استخراج، EDTA، هموگلوبین یا نمک‌های زیاد می‌توانند عملکرد Taq DNA polymerase را مختل کنند.
• این عوامل ممکن است از منبع نمونه (مانند خون یا بافت) یا فرآیند استخراج ناشی شوند.

 .2-4 آلودگی میکروبی یا نوکلئیک‌اسیدهای غیرهدف

• حضور DNA غیرهدف موجب تکثیر غیراختصاصی و تغییر در منحنی ذوب می‌شود که تشخیص محصول صحیح را دشوار می‌سازد.

بیشتر بخوانید “ویروس کرونای جدید“…

3. عوامل مرتبط با طراحی واکنش

3-1 . طراحی پرایمر

• اختلاف زیاد دمای ذوب (Tm) بین پرایمرهای Forward و Reverse یا وجود ساختارهای ثانویه و دایمر شدن باعث کاهش کارایی اتصال می‌شود.
• هدف‌گیری توالی‌های مشابه به جای توالی اختصاصی می‌تواند منجر به سیگنال ضعیف یا غیرهدف شود.

3-2 . ترکیب و غلظت واکنشگرها

• غلظت نامناسب پرایمر (خیلی کم → سیگنال ضعیف، خیلی زیاد → تکثیر غیرهدف)
• غلظت ناکافی یون Mg²⁺ که برای اتصال پرایمر و فعالیت آنزیم ضروری است.
• استفاده از dNTP، بافر یا آنزیم تاریخ گذشته یا به‌درستی ذخیره‌نشده.

4 .عوامل مرتبط با شرایط PCR و عملکرد دستگاه

 . 4-1 بهینه نبودن برنامه حرارتی (Thermal Cycling Program)

• دمای Annealing بسیار بالا موجب کاهش اتصال پرایمر، و دمای پایین باعث افزایش تکثیر غیرهدف می‌شود.
• زمان Extension ناکافی برای توالی‌های طولانی کارایی واکنش را کاهش می‌دهد.

4-2 .مشکلات دستگاهی

• کالیبراسیون نامناسب کانال فلورسانس یا بلوک حرارتی موجب قرائت اشتباه سیگنال می‌شود.
• استفاده از کانال اشتباه برای SYBR Green یا عدم تنظیم صحیح نرم‌افزار آنالیز.

4-3 . فقدان کنترل‌های مناسب

• نبود کنترل مثبت باعث عدم تشخیص مشکلات واکنش از مشکلات نمونه می‌شود.
• نبود کنترل منفی (NTC) مانع شناسایی آلودگی یا تکثیر غیراختصاصی خواهد شد.

5. نتیجه‌گیری

بروز نتیجه منفی در Real-Time PCR با SYBR Green می‌تواند ناشی از ترکیبی از عوامل مربوط به کیفیت نمونه، طراحی و ترکیب واکنش، و شرایط اجرای PCR باشد. رعایت اصول استخراج، نگهداری مناسب نمونه، طراحی بهینه پرایمر، استفاده از واکنشگرهای تازه و کنترل‌های دقیق، نقش اساسی در کاهش خطا و بهبود حساسیت این روش دارند.