آنزیم پروتئیناز K
پروتئیناز (proteinase K):
یک آندوپپتیداز سرین وابسته به تتیلیسین است که انواع پیوندهای پپتید را هیدرولیز می کند. پروتئیناز K در شرایط متفاوتی از دما و بافر با فعالیت مطلوب بین 20 تا 60 درجه سانتیگراد و pH بین 7.5 و 12.0 فعال است.
آنزیم در سال 1974 در عصاره های آلبوم قارچ Engyodontium کشف شد. این آنزیم قادر به هضم کراتین است و وزن مولکولی آن (28.9 کیلو دالتون) است.
عملکرد و فعالیت آنزیم:
گرچه یونهای کلسیم فعالیت آنزیم را تحت تأثیر قرار نمی دهند ، اما در غلظت 1 – 5 ماکرومول در ثبات آن موثر است. یک ویژگی جالب پروتئیناز K این است که فعالیت خود را در حضور (SDS) یا اوره حفظ می کند. (0.5 – 1٪ SDS و 1 – 4 M اوره). بالا بردن دمای واکنش از 37 درجه سانتیگراد به 50 – 60 درجه سانتیگراد می تواند فعالیت را در چندین برابر بالا ببرد. از دیگر ویژگی های پروتئیناز K توانایی آن در هضم پروتئین های بومی است و از این طریق آنزیم هایی مانند DNase و RNase را بدون مراجعه به یک فرآیند دناتوراسیون غیرفعال می کند.
این آنزیم حداقل 2 سال در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد پایدار است. هیچ افت فعالیتی بعد از 10 چرخه انجماد ذوب مشاهده نمی شود.این آنزیم علاوه بر شکاف پیوندهای پپتید ، می تواند هیدرولیز پپتید آمید را کاتالیز کند. پروتئیناز K توسط دییزوپروپیل فلوروفسفات (DFP) یا فنیل متان سولفونیل فلوراید (PMSF) غیرفعال می شود. عوامل چلاتی مانند سیترات و EDTA هیچ تاثیری در فعالیت آنزیم ندارند.همچنین دماهای بالاتر از 65 درجه سانتیگراد ، تری کلرواستیک استیک (TCA) یا مهارکننده های پروتئیناز سرین AEBSF ، PMSF یا DFP فعالیت را مهار می کنند. پروتئیناز K توسط Guanidinium chloride ، Guanidinium tiocyanate ، اوره ، سارکوزیل ، Triton X-100 ، Tween 20، SDS ، سیترات ، یدواستریک اسید ، EDTA یا سایر مهار کننده های پروتئین سرین مانند Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) . و Nα-Tosyl-Phe کلرومتیل کتون (TPCK)مهار نخواهد شد.
مکانیسم عمل پروتئیناز K :
اتصال: پروتئیناز K ابتدا از طریق فعل و انفعالات آبگریز غیر اختصاصی به سوبسترای پروتئین یا اسید نوکلئیک متصل می شود.
فعال سازی: پس از اتصال، آنزیم تحت یک مرحله فعال سازی قرار می گیرد که در آن یک اسیدآمینه سرین کاتالیزوری توسط یک اسیدآمینه هیستیدین و یک مولکول آب فعال می شود. این واکنش منجر به تشکیل یک جایگاه فعال می شود که می تواند پیوندهای پپتیدی را بشکند.
برش: جایگاه فعال پروتئیناز K پیوند پپتیدی را در سمت کربوکسیلیک اسید آمینو اسیدها که شامل آمینو اسیدهای آروماتیک، آلیفاتیک یا آبگریز هستند، می‌شکند.
آزاد سازی محصول: پس از برش، محصولات واکنش (یعنی پپتیدها) از آنزیم آزاد می شوند.
مکانیسم اثر پروتئیناز K مشابه سایر پروتئازهای سرین است، اما به دلیل داشتن عملکرد و کارآیی در شرایط سخت، مانند دمای بالا و در حضور مواد شوینده قابل توجه است.
تفاوت پروتئاز و پروتئیناز:
پروتئاز ها هیدرولاز هستند و مخصوص پیوندهای پپتید هستند. پروتئازها به دو گروه تقسیم می شوند: آنهایی که پیوندهای پپتیدی بین اسید آمینه ترمینال (انتهای آمینو یا کربوکسیلیک) را هیدرولیز می کنند و دسته دوم آنزیم هایی که هیدرولیز کردن پیوندهای داخلی پپتید را هیدرولیز می کنند. اولین آنزیم ها با برچسب اگزوپپتیداز یا پپتیداز و دومین مجموعه آنزیم ها اندوپپتیداز یا پروتئیناز هستند .
ویژگی ها و مزایای پروتئیناز (proteinase K) :
- غیرفعال کردن DNases و RNases اکثر گونه ها.
- کیفیت و عملکرد مداوم
- آنزیم قوی در طیف وسیعی از pH پایدار است و برای کاربردهای متنوع ایده آل است.
- آنزیم بدون آلودگی. آنزیم به دلیل عدم وجود RNases و DNases مورد آزمایش قرار می گیرد و عملا عاری از DNA است. به خصوص برای جداسازی الگوهای PCR مناسب است.
کاربردهای پروتئیناز (proteinase K):
- جداسازی پلاسمید و DNA ژنومی
- جداسازی RNA
- غیرفعال کردن RNases ، DNases و آنزیم ها در واکنش ها
- حذف آنزیم ها از DNA برای بهبود راندمان کلونینگ
- تصفیه PCR
- جداسازی میتوکندری
- از بین بردن اندوتوکسین های وابسته به پروتئین های کاتیونی ، مانند لیزوزیم و ریبونوکلئاز A
- تعیین محلی سازی آنزیم بر روی غشاها
- قرار گرفتن در معرض مکان های اتصال آنتی ژن در بخش های بافت تعبیه شده با پارافین برای برچسب زدن آنتی بادی
- هضم پروتئین ها از نمونه های بافت مغزی
- محصولات پروتئیناز K
- ارتقای لیز سلول با فعال کردن یک عامل اتولیتیک باکتریایی
- تجزیه و تحلیل ساختار غشایی با اصلاح پروتئین ها و گلیکوپروتئین ها روی سطوح سلولی
- جداسازی اسیدهای نوکلئیک برای واکنشهای تقویت شده
- از بین بردن بقایای سلولی در هنگام آماده سازی بالابرهای کلونی ، و برای درمان قسمتهای بافت برای اطمینان از نفوذ پروب کارآمد
هضم پروتئین توسط پروتئیناز K :
پروتئیناز K معمولاً در بیولوژی مولکولی برای هضم پروتئین و از بین بردن آلودگی از آماده سازی اسید نوکلئیک استفاده می شود . افزودن پروتئیناز K به آماده سازی اسید نوکلئیک به سرعت هسته های غیرفعال شده را که در غیر این صورت ممکن است DNA یا RNA را در طول تصفیه تخریب کند غیرفعال می کند. این برنامه کاربردی بسیار مناسب است زیرا این آنزیم در حضور مواد شیمیایی حاوی پروتئین ها ، مانند SDS و اوره ، مواد شل کننده مانند EDTA ، معرفهای سولفیدریل و همچنین مهار کننده های تریپسین یا کیموتریپسین فعال است .
جداسازی نوکلئیک اسیدها توسط پروتئیناز K :
پروتئیناز K برای از بین بردن پروتئین ها در لیز سلول ها (بافت ، سلول های کشت سلول) و برای آزاد سازی اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود ، زیرا بسیار موثر DNases و RNases را غیرفعال می کند. پروتئیناز K در جداسازی DNA یا RNA های بسیار بومی ، آسیب دیده و غیرمستقیم بسیار مفید است ، زیرا اکثر DNases میکروبی یا پستانداران و RNases به سرعت با استفاده از آنزیم غیرفعال می شوند ، خصوصاً در صورت وجود 0.5 تا 1٪ SDS. همچنین تصفیه DNA ژنومی از باکتریها به این صورت که باکتریهای حاصل از کشت مایع اشباع لیز می شوند و پروتئین ها توسط یک هضم با 100 میکروگرم بر میلی لیتر پروتئیناز K به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتیگراد برداشته می شوند.
فعالیت آنزیم نسبت به پروتئین های بومی توسط دناتورسانت ها مانند SDS تحریک می شود. در مقابل ، هنگامی که با استفاده از بسترهای پپتید اندازه گیری می شود ، دناتورسانتها آنزیم را مهار می کنند . دلیل این نتیجه این است که مواد دناته کننده کننده لایه های پروتئینی را باز می کنند و آنها را به پروتئاز در دسترس تر می کنند.
نقش پروتئیناز K در استخراج DNA :
بخش عمده سلول از پروتئین تشکیل شده است. غشای هسته ای ، آنزیم ها ، لیگاند ها ، گیرنده ها ، چاپون ها ، آنتی بادی ها و سایر افسانه های خاص گیرنده تنها پروتئین تشکیل شده اند.
همچنین ، غشای سلولی و غشای هسته ای از پروتئین کامپوزیت مانند فسفولیپید ، گلیکوپروتئین و اسفنگومیلین تشکیل شده است. این مولکولهای مختلفی هستند که از پروتئین ها ساخته شده اند و برخی از لیپیدها ، کربوهیدراتها و سایر مولکولها را تشکیل می دهند.
پروتئیناز K قسمت پروتئینی این مولکول ها را هضم می کند. علاوه بر این ، پروتئین مرتبط با DNA را هضم می کند. این پروتئین از زنجیره طولانی اسیدهای آمینه ساخته شده است. بسته به ماهیت تعامل آنها با آب ، به اسیدهای آمینه آبگریز (جذب آب) و آبگریز (دفع آب) طبقه بندی می شوند.
این آنزیم عمدتاً اسیدهای آمینه آبگریز را هضم می کند. کوفاکتور ، یون کلسیم ثبات در آنزیم را فراهم می کند ، با این حال نمی تواند فعالیت واکنش را افزایش دهد.
