تکنیک LAMP – روش و کاربردهای آن
تکنیک LAMP
تکنیک (LAMP ( Loop-mediated isothermal amplification یا بعبارتی تکثیر هم‌دمای متصل به حلقه یا تکثیر ایزوترمال متصل به حلقه ، یک تکنیک تک‌لوله‌ای برای تکثیر DNA است. این روش انقلابی در آزمایشگاه های تشخیصی برای تشخیص بیماری های خاص بوده است . همچنین این تکنیک ممکن است با رونویسی معکوس برای شناسایی RNA نیز ترکیب شود.
روش LAMP
تکثیر ایزوترمال DNA
تکثیر ایزوترمال DNA یکی از روش‌های پیشرفته در زیست‌مولکولی است که برخلاف PCR، در دمای ثابت انجام می‌شود و نیازی به دستگاه ترموسایکلر ندارد. این روش با حفظ دما در یک بازه مشخص، امکان تکثیر DNA را بدون تغییرات متناوب دما فراهم میکند.
روش LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)
در روش LAMP، تکثیر توالی هدف در دمای ثابت ۶۰ تا ۶۵ درجه سانتی‌گراد انجام می‌شود. این فرآیند با استفاده از آنزیم Bst DNA polymerase که علاوه بر فعالیت رونویسی، توانایی جابجایی رشته بالایی را دارد، صورت می‌گیرد.
استفاده از پرایمرهای ویژه
در این روش، برای شناسایی ۶ ناحیه متمایز در ژن هدف، از ۴ پرایمر متفاوت استفاده می‌شود که به شدت به ویژگی تکثیر کمک می‌کنند. همچنین، یک جفت پرایمر حلقه‌ای اضافی به کار می‌رود که باعث تسریع بیشتر واکنش می‌شود. به دلیل طراحی خاص این پرایمرها، مقدار DNA تولید شده در روش LAMP به‌طور قابل توجهی بیشتر از PCR است.
تولید رسوب منیزیم پیروفسفات و تشخیص محصول
در طی تکثیر DNA با روش LAMP، مقدار زیادی رسوب منیزیم پیروفسفات به عنوان محصول جانبی تولید می‌شود که باعث تیرگی محلول می‌گردد. این تیرگی به کمک فتومتری قابل شناسایی است. فتومتری امکان تشخیص آسان با چشم غیرمسلح را فراهم میکند، به‌ویژه در واکنش‌هایی با حجم بالا.
تشخیص در لحظه با فلورسانس
تشخیص محصول تکثیر شده در روش LAMP به صورت ریل تایم یا در لحظه با استفاده از رنگ‌های فلورسانس مانند SYTO9 انجام می‌شود. همچنین، از رنگ‌هایی مانند سایبرگرین برای ایجاد تغییر رنگ قابل مشاهده با چشم غیرمسلح یا تشخیص دقیق‌تر با تجهیزات اندازه‌گیری استفاده می‌شود.
کاربرد رنگ‌های فلورسانس در تشخیص کمی
رنگ‌های فلورسانس می‌توانند به DNA متصل شوند یا آن را به‌طور مستقیم برچسب‌گذاری کنند. این ویژگی به محققان امکان می‌دهد تعداد نسخه‌های DNA را به‌طور کمی شناسایی کنند. بنابراین، روش LAMP علاوه بر کیفی بودن، یک تکنیک کمی نیز محسوب می‌شود.
تشخیص درون لوله‌ای و واکنش فلورسانس
در روش LAMP، تشخیص آمپلیکون‌های DNA درون لوله‌ای با استفاده از کلسین بارگذاری شده با منگنز انجام می‌شود. طی واکنش سنتز DNA به صورت in vitro، کلسین با ترکیب منگنز و پیروفسفات واکنش فلورسانس را آغاز میکند.
تشخیص با استفاده از نانوذرات طلا (AuNP)
روش LAMP همچنین قابلیت تشخیص آمپلیکون‌ها با استفاده از نانوذرات طلا (AuNP) را دارد. در این روش، آمپلیکون‌ها به ss-DNA متصل به طلا متصل شده و از تغییر رنگ قرمز به بنفش آبی که ناشی از تجمع ذرات طلا در حضور نمک است، جلوگیری می‌کنند. این ویژگی، شناسایی آمپلیکون‌ها را با چشم غیرمسلح ممکن می‌سازد.
مزایای روش LAMP همراه با AuNP
استفاده از LAMP همراه با تشخیص آمپلیکون‌ها به وسیله AuNP دارای مزایای زیر است:
- کاهش زمان تست
- تثبیت آمپلیکون با هیبریداسیون
- استفاده از تجهیزات ساده‌تر (عدم نیاز به ترموسایکلر، تجهیزات الکتروفورز و لامپ UV)
روش LAMP به دلیل دقت بالا، سرعت بیشتر و نیاز به تجهیزات کمتر، به‌عنوان یک تکنیک قدرتمند در زیست‌مولکولی و بیوتکنولوژی شناخته می‌شود.
کاربردها و مزایای تکنیک LAMP
LAMPیک تکنیک نسبتاً جدید برای تکثیر DNA است که به خاطر کم هزینه و ساده بودن روش ، میتواند مزایای زیادی در آزمایشگاه ها داشته باشد. تکنیک LAMP میتواند به عنوان یک تست غربالگری ساده در زمینه مراقبت توسط پزشکان مورد استفاده قرار گیرد. از آنجایی که تکنیک LAMP به صورت ایزوترمال است و نیاز به ترموسایکلر گران‌قیمت درتکنیک PCR معمولی را مرتفع میکند.
همچنین LAMP می تواند یک تکنیک بسیار ارزشمند برای تشخیص بیماری‌های عفونی در کشورهای کم درآمد و متوسط باشد.
LAMP در مقایسه با PCR نسبت به مهارکننده‌های موجود در نمونه‌های پیچیده مثل خون حساسیت کمتر و مقاومت بیشتری دارد و این وجه تمایز به دلیل استفاده ازیک آنزیم DNA پلیمراز متفاوت بنام آنزیم Bst DNA polymerase است. گزارش‌های متعدد حاکی از موفقیت‌آمیز بودن تشخیص پاتوژن‌ها در نمونه‌های کمتر فراوری شده مثل خون‌گرم شده یا در حضور نمونه بالینی است. این متمایز بودن تکنیک LAMP ممکن است در تنظیمات کم منابع یا کم زمینه مفید باشد، زیرا استخراج DNA یا RNA متعارف قبل از آزمایش‌های تشخیصی غیرممکن است.
محدودیت های تکنیک LAMP
تکنیک LAMP در مقایسه با متداول ترین روش تکثیر DNA ( PCR) بطور ویژه ای یک روش تشخیصی مفید تلقی می‌شود ولی برای کلونینگ و هزاران کاربرد زیست‌شناسی مولکولی که با PCR انجام می‌شوند، ناکارآمد است؛ زیرا در روش LAMP از ۴یا۶ پرایمر استفاده می‌شود که ۶ یا ۸ ناحیه را در یک بخش نسبتاً کوچک از ژنوم، هدف قرار می‌دهد و چون طراحی پرایمر محدودیت‌های زیادی دارد، طراحی آن‌ها با چشم مشکل می‌شود. به‌طور کلی برای کمک به طراحی پرایمر، بسته‌های نرم‌افزاری رایگان یا تجاری مورد استفاده قرار می‌گیرند، گرچه محدودیت‌های طراحی پرایمر به معنای آزادی کمتر در انتخاب توالی هدف نسبت به PCR است.
رویکردهای Multiplexing برای LAMP کمتر از PCR توسعه یافته‌است. تعداد بیشتر پرایمر به ازای هر هدف در LAMP احتمال برهم کنش پرایمر-پرایمر را افزایش می‌دهد. محصول روشLAMP یک مجموعه به هم پیوسته از منطقه هدف است که باعث ایجاد یک حالت نردبانی روی ژل می‌شود. بر خلافPCR که یک باند واحد روی ژل تشکیل می‌شود.
اگر چه این مسئله هنگام شناسایی اهداف واحد مشکلی ایجاد نمی‌کند، اما برنامه‌های PCR چندگانه سنتیend point که در آن هویت یک هدف توسط اندازه باند بر روی ژل تعیین می‌شود با LAMP امکان‌پذیر نیست. Multiplexing در LAMP با انتخاب یک منطقه هدف با توالی محدود و دستیابی به تجزیه قبل از اجرا بر روی ژل انجام می‌شود. به طوری که هر محصول با اندازه خاص خودش مشخص می‌شود. اگرجه این روش باعث پیچیدگی دستورالعمل و طراحی تجربی می‌شود.
