ارتباط مستقیم با کارشناس فروش
استخراج DNA به روش CTAB
استخراج DNA ژنومی به روش CTAB: اصول، اجرا و ارزیابی کیفیت
استخراج DNA ژنومی با کیفیت و کمیت مناسب، یکی از مراحل کلیدی در مطالعات مولکولی بهویژه در گیاهان و نمونههای غنی از پلیساکارید و ترکیبات فنلی است. روش CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) بهعنوان یکی از رایجترین و مؤثرترین روشها برای این نوع نمونهها شناخته میشود. در این مقاله، یک پروتکل اصلاحشده و عملی برای استخراج DNA به روش CTAB ارائه شده و کیفیت DNA استخراجشده از طریق بررسی جذب نوری و الکتروفورز ارزیابی شده است.
مقدمه
DNA ژنومی ماده اولیه بسیاری از تکنیکهای زیستمولکولی مانند PCR، تعیین توالی و نشانگرهای مولکولی است. در نمونههای گیاهی، وجود مقادیر بالای پلیساکاریدها و ترکیبات فنلی میتواند باعث کاهش کیفیت DNA استخراجشده شود. این ترکیبات معمولاً با DNA همرسوب شده و در واکنشهای آنزیمی اختلال ایجاد میکنند.
روش CTAB بر اساس خاصیت دترجنت کاتیونی CTAB در اتصال به پلیساکاریدها و جداسازی آنها از DNA طراحی شده است. استفاده از نمک با غلظت بالا و عوامل احیاکننده مانند β-mercaptoethanol، این روش را به گزینهای مناسب برای استخراج DNA با خلوص بالا تبدیل کرده است.
مواد و روشها
مواد مورد نیاز
- بافر CTAB (شامل CTAB، Tris-HCl، EDTA و NaCl)
- β-mercaptoethanol
- کلروفرم:ایزوآمیل الکل (24:1)
- ایزوپروپانول سرد
- اتانول 70٪
- RNase A
- بافر TE
- هاون و نیتروژن مایع (در صورت استفاده از بافت گیاهی)
روش کار استخراج DNA گیاهی به روش CTAB
آمادهسازی نمونه گیاهی:
حدود 100 میلیگرم از بافت تازه یا خشکشده گیاه (برگ، ساقه یا ریشه) با استفاده از هاون و به کمک نیتروژن مایع کاملاً آسیاب میشود تا دیواره سلولی شکسته و نمونه به پودر نرم تبدیل شود.لیز سلولی با بافر CTAB:
پودر نمونه در بافر CTAB پیشگرمشده (65°C) حل شده و مقدار مناسبی β-mercaptoethanol به آن اضافه میشود. نمونه به مدت 30 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد انکوبه و هر 10 دقیقه بهآرامی مخلوط میشود.
منطق: CTAB غشای سلولی را تخریب و پروتئینها و پلیساکاریدها را از DNA جدا میکند، در حالی که β-mercaptoethanol مانع اکسید شدن ترکیبات فنلی میشود.جداسازی فاز آبی و آلی:
حجم مساوی کلروفرم:ایزوآمیل الکل (24:1) به نمونه اضافه میشود و مخلوط پس از همزدن ملایم سانتریفیوژ میشود. فاز آبی فوقانی که حاوی DNA است به لوله جدید منتقل میشود، در حالی که پروتئینها و لیپیدها در فاز آلی باقی میمانند.رسوبدهی DNA:
ایزوپروپانول سرد به فاز آبی اضافه شده و نمونهها برای 30 دقیقه در دمای -20°C نگه داشته میشوند تا DNA رسوب کند.شستشوی DNA:
DNA رسوب کرده با اتانول 70٪ شسته میشود تا نمکها و ناخالصیهای باقیمانده حذف شوند. سپس رسوب خشک شده و آماده حلسازی در بافر TE است.حذف RNA:
برای حذف RNA، نمونه DNA با RNase A تیمار میشود. پس از 10–15 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق، DNA آماده استفاده در واکنشهای مولکولی است.ارزیابی کیفیت و کمیت:
اندازهگیری جذب نوری: نسبت A260/A280 در محدوده 1.8–2.0 نشاندهنده DNA با خلوص مناسب است.
الکتروفورز ژل آگارز: DNA سالم به صورت باندهای واضح و بدون smear شدید قابل مشاهده است.
این روش مناسب استخراج DNA از بافتهای گیاهی حتی غنی از پلیساکارید و ترکیبات فنلی است و DNA حاصل برای PCR، تعیین توالی و کلونینگ آماده است.
ارزیابی کیفیت و کمیت DNA
جذب نوری
جذب نمونهها در طول موجهای 260 و 280 نانومتر اندازهگیری شد. نسبت A260/A280 در محدوده 1.8 تا 2.0 نشاندهنده خلوص مناسب DNA بود.
الکتروفورز ژل آگارز
DNA استخراجشده روی ژل آگارز 1٪ بارگذاری شد. مشاهده باندهای واضح و بدون smear شدید، نشاندهنده عدم تخریب DNA و کیفیت بالای استخراج بود.
نتایج
DNA استخراجشده به روش CTAB دارای کمیت مناسب و خلوص بالا بود. نسبت جذب نوری نشان داد که آلودگی پروتئینی قابل توجهی وجود ندارد. الکتروفورز ژل نیز باندهای مشخص و با وزن مولکولی بالا را نشان داد که بیانگر سلامت DNA ژنومی است.
بحث
کارایی بالای روش CTAB بهویژه در نمونههای گیاهی به دلیل توانایی این روش در حذف پلیساکاریدها و ترکیبات فنلی است. استفاده از β-mercaptoethanol نقش مهمی در جلوگیری از اکسیداسیون ترکیبات فنلی و اتصال آنها به DNA دارد. نتایج این مطالعه نشان میدهد که پروتکل ارائهشده برای کاربردهای مولکولی بعدی کاملاً مناسب است.
نتیجهگیری
روش CTAB یک روش قابل اعتماد، اقتصادی و مؤثر برای استخراج DNA ژنومی با کیفیت بالا است. پروتکل ارائهشده در این مقاله میتواند بهعنوان یک روش استاندارد در آزمایشگاههای زیستمولکولی مورد استفاده قرار گیرد.
سؤالات متداول درباره استخراج DNA به روش CTAB
۱. روش CTAB چیست و چرا در استخراج DNA استفاده میشود؟
روش CTAB یک روش شیمیایی مبتنی بر دترجنت کاتیونی است که برای لیز سلولی و جداسازی DNA از پروتئینها و پلیساکاریدها استفاده میشود. این روش بهویژه برای نمونههای گیاهی و نمونههای غنی از ترکیبات مزاحم بسیار کارآمد است.
۲. نقش CTAB در استخراج DNA چیست؟
CTAB با تخریب غشای سلولی و تشکیل کمپلکس نامحلول با پلیساکاریدها، مانع همرسوبی آنها با DNA میشود و به افزایش خلوص DNA استخراجشده کمک میکند.
۳. چرا از دمای ۶۵ درجه سانتیگراد در روش CTAB استفاده میشود؟
این دما باعث افزایش کارایی لیز سلولی، دناتوره شدن پروتئینها و غیرفعال شدن آنزیمهای تخریبکننده DNA میشود، بدون آنکه به ساختار DNA ژنومی آسیب وارد شود.
۴. دلیل استفاده از کلروفرم:ایزوآمیل الکل در این روش چیست؟
این ترکیب باعث جداسازی مؤثر پروتئینها و لیپیدها به فاز آلی میشود و DNA در فاز آبی باقی میماند. ایزوآمیل الکل از تشکیل کف و امولسیون پایدار جلوگیری میکند.
۵. چرا ایزوپروپانول برای رسوبدهی DNA بهکار میرود؟
ایزوپروپانول باعث رسوب سریع DNA با حجم کمتر نسبت به اتانول میشود و برای رسوبدهی DNA ژنومی بسیار مؤثر است.
۶. نسبت جذب نوری مناسب برای DNA استخراجشده چقدر است؟
نسبت A260/A280 در محدوده 1.8 تا 2.0 نشاندهنده DNA با خلوص بالا و آلودگی پروتئینی کم است.
۷. چرا روش CTAB برای استخراج DNA گیاهی مناسب است؟
زیرا گیاهان دارای دیواره سلولی ضخیم، پلیساکاریدها و ترکیبات فنلی هستند و CTAB توانایی بالایی در حذف این ترکیبات و جلوگیری از مهار واکنشهای آنزیمی دارد.
