نقش Tris-HCl در استخراج DNA

بافر Tris-HCl

Tris-HCl یک عامل بافری است که معمولاً توسط زیست شناسان مولکولی استفاده می شود. Tris HCl که به صورت تجاری در دسترس است  به Tris ، HCl اضافه شده است.

موارد استفاده بافر Tris-HCl

می توان از آن در دستور العمل های بافرهای رایج مانند بافرهای زیر استفاده کرد:

• بافر استخراج DNA CTAB
• بافر Leammli برای SDS-PAGE
• بافر TAE
• بافر TBE
• بافر TE
• محلول بافر تریس HCl

اینکه از Tris HCl یا Tris base برای تهیه هرکدام از این بافرها استفاده می شود،  بستگی به پروتکلی دارد که با آن کار می کنید. هنگامی که نیاز به تنظیم pH محلول خود دارید، می توانید از  یک ترکیب اسیدی یا بازی برای تنظیم pH استفاده کنید. به عنوان مثال، اگر از پروتکلی استفاده می کنید که  به تریس HCl  نیاز دارید، می توانید pH را با استفاده از پایه تریس تنظیم کنید.

تریس هیدروکلراید گرید بیولوژی مولکولی

تریس، هیدروکلراید (درجه زیست شناسی مولکولی) معمولاً به عنوان یک جزء از  بافر استخراج DNA یاRNA به روش فنول و نیز به عنوان یک جزء از بافر ژل های  SDS-PAGE استفاده می شود. تریس، هیدروکلراید همچنین با اوره به عنوان روشی برای بازیابی آنتی ژن در ایمونوهیستوشیمی استفاده شده است.

مراحل استخراج DNA

برای استخراج DNA پنج مرحله اساسی وجود دارد:

1. اختلال در ساختار سلولی برای ایجاد لیز (لیز سلولی)
2. جداسازی DNA محلول از بقایای سلولی و سایر مواد نامحلول
3. اتصال DNA
4. شستشوی پروتئین ها و سایر آلاینده ها از ماتریکس
5. شستشوی DNA

در مراحل استخراج مرحله ی اول که مرحله لیز سولی است یکی از مهمترین مراحل در مسیر استخراج به شمار می رود. جهت لیز سلولی به بافر استخراج نیاز است.

بافر لیز سلولی اولین جزء حیاتی برای هر پروتکل جداسازی است. این  بافر برای اولین مرحله استخراج پروتئین یا اسید نوکلئیک ضروری است، زیرا به تجزیه شیمیایی غشاها و بخش های سلولی کمک می کند و مولکول های هدف را قادر می سازد سلول را ترک کنند. انواع مختلفی از بافرهای لیز وجود دارد. ساخت اکثر آنها آسان است، اما بیشتر آنها به صورت تجاری در دسترس هستند. آنها اغلب در کیت هایی برای رسوب ایمنی، جداسازی اسید نوکلئیک و موارد دیگر گنجانده می شوند. هنگام استفاده از بافر لیز برای جداسازی پروتئین، افزودن مهارکننده های پروتئاز به طور کلی به منظور محافظت از پروتئین ها توصیه می شود.

بافر لیز سلولی باید شیمی غشاء را مختل کند اما مولکول های هدف را نیز حفظ کند. نوع بافر لیز مورد استفاده بر اساس هدف آزمایش تعیین می شود. با این حال، بیشتر بافرهای لیز سلولی حاوی مواد شوینده ای هستند که لایه دوتایی لیپیدی غشای سلولی را مختل می کند. اگر هدف آزمایشی مستلزم حفظ ساختار پروتئین سوم  باشد، بافر لیز سلولی باید غیردناتوره باشد. بافرهای غیر دناتوره معمولا حاوی مواد شوینده غیر یونی مانند NP-40 یا Triton X-100 هستند. اینها سورفکتانت هایی با ترکیب شیمیایی صابون هستند که لایه دوگانه اسید چرب را مختل می کنند. این بافرهای غیر دناتوره کننده غلظت نمک پایینی دارند، معمولاً کمتر از 120 میلی مولار NaCl. با این حال، مقداری نمک برای جلوگیری از فعل و انفعالات غیر اختصاصی پروتئین مورد نیاز است. اتیلن دی آمین تترا استیک اسید یا EDTA یک افزودنی رایج است که عملکردهای متعددی از جمله مهار پروتئاز و محافظت در برابر آسیب اکسیداتیو دارد. تریس افزودنی دیگری است که برای بافر pH و جلوگیری از دناتوره شدن پروتئین استفاده می شود.

بافر جهت استخراج پروتئین

گاهی اوقات برای استخراج پروتئین ها به یک بافر دناتوره کننده نیاز است. اگر چنین باشد، سدیم دودسیل سولفات (SDS) و شوینده‌های سدیم-دئوکسی کولات در بافر لیز سلولی گنجانده می‌شوند. گاهی اوقات بافر دناتوره کننده  به حرارت دادن تا دمای 95 درجه سانتیگراد نیاز دارد.

کلمه Lysis از کلمه یونانی به معنای سست کردن گرفته شده است. لیز سلولی فرآیند تخریب غشاء یا دیواره سلول است. هدف از بافر لیز سلولی ، استفاده از یک مخلوط شیمیایی برای برهم زدن محیط بیرونی سلول است به نحوی که باعث تخریب دیواره سلول و آزاد شدن محتویات آن شود. بافر لیز مورد نیاز شما بستگی به این دارد که چه موادی را می خواهید از سلول استخراج کنید. چندین مؤلفه برای بافر لیز سلولی شما وجود دارد مانند pH، نمک ها، مواد شوینده، استفاده یا عدم استفاده از مهارکننده های پروتئاز، برای ساختن بافر لیز سلولی باید بافری را انتخاب کنید که با پروتئین شما سازگار باشد، معمولاً Tris- HCl یا HEPES-NaOH که دارای محدوده pH متفاوتی هستند که نیاز است در نظر گرفته شوند. همچنین می توانید از نمک هایی مانند NaCl یا KCl برای افزایش قدرت یونی بافر خود استفاده کنید که باعث اختلال در فعل و انفعالات مولکولی می شود.

بافرها دارای قدرت های متفاوتی هستند و بر اساس اینکه آیا پروتئین های استخراج شده باید دناتوره شوند یا خیر انتخاب می شوند. سدیم دودسیل سولفات یک محلول یونی است که به اندازه کافی قوی است تا پروتئین ها را حل کند و آنها را دناتوره کند. ماده ضعیف تری مانند NP-40 می تواند برای حل کردن پروتئین ها استفاده شود اما آنها را دناتوره نمی کند. در نهایت، زمانی که خطر اثر پروتئازها بر پروتئین مورد نظر شما وجود دارد، یک مهارکننده پروتئاز نیز در نظر گرفته می شود.

PH مناسب  بافر

اطمینان حاصل کنید که بافر انتخابی شما در pH انتخابی عملکرد خوبی دارد. برای اطمینان از نتایج خوب، از یکی با مقدار pKa در یک واحد pH مورد نظر خود استفاده کنید و غلظت آن را بین 50 تا 100 میلی‌مولار حفظ کنید.

محلول بافری را انتخاب کنید که از نظر شیمیایی پایدار باشد و سازگاری بافر با برنامه های پایین دستی بعدی را نیز در نظر بگیرید.لیز کردن سلول ها برای استخراج اسیدهای نوکلئیک از برخی جهات بسیار ساده تر از استخراج پروتئین ها است. اسیدهای نوکلئیک نسبت به بسیاری از پروتئین ها در برابر دناتوره شدن بسیار مقاوم تر هستند، بنابراین می توان از بافر لیز دناتوره کننده استفاده کرد. نوع بافر لیز به نوع اسید نوکلئیک مانند DNA ژنومی، میتوکندری یا پلاسمید و کل RNA و همچنین منبع سلولی بستگی دارد.

شستشوی DNA با بافر Tris-HCl

در برخی مطالعات مشخص شده است که استفاده از Tris-HCl یک روش قابل اعتماد و موثر برای شستشوی DNA از کارت های قدیمی خون انسان است. DNA جدا شده توسط Tris-HCl را می توان برای مطالعه پلی مورفیسم های ژنتیکی در جمعیت های انسانی مورد استفاده قرار داد.

از آنجایی که لیز سلولی و استخراج اسیدهای نوکلئیک به اندازه پروتئین ها در معرض متغیرهای زیادی نیست، بیشتر استخراج اسید نوکلئیک را می توان با یکی از چند کیت انجام داد. کیت ها معمولاً حاوی یک بافر لیز سلولی و یک ماتریکس مناسب اتصال به اسید نوکلئیک هستند.

شرکت یکتا تجهیز آزما طیف وسیعی از کیت‌ها را برای آماده‌سازی و خالص‌سازی نمونه اسید نوکلئیک ارائه می‌کند.

سوالات متداول