عیب یابی و رفع آن در استفاده از کیت استخراج DNA از خون
مطالعات سلامت انسان در زمینه زیست شناسی مولکولی نیاز به استفاده از دی اکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA)، اسید ریبونوکلئیک (RNA) و نمونه های پروتئینی دارد. موفقیت در واکنش های پایین دستی وابسته به استفاده از DNA با کمیت و کیفیت بالا می باشد. بنابراین، استخراج اسید نوکلئیک یک مرحله کلیدی مورد نیاز در پروژه های تحقیقاتی مولکولی است بنابراین انتخاب یک روش استخراج مناسب ضروری به نظر می رسد. خون منبع اصلی DNA برای مطالعات مرتبط با ژنوتیپ در انسان است. یک روشی سریع وکارآمد برای جداسازی DNA ژنومی از خون کامل مورد نیاز است. گاهی بعد از پروسه استخراج DNA از خون با یکسری از مشکلات غیرطبیعی از جمله غلظت پایین یا عدم وجود محصول،کیفیت پایین روبه رو می شوید. پیشنهاد میکنیم قبل از استفاده از کیت استخراج DNA از خون موارد و نکات زیر را به دقت مطالعه فرمایید.
از جمله مشکلات فنی در استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA از خون ، ادعای کاربر در مقدار بسيار كم DNA استخراج شده میباشد.
در ذیل به اختصار چند تا از نکات مهم و موثر در بروز این مشکل عنوان میشود که از مهمترین عوامل موثر در عدم یا مقدار بسیار کم DNA استخراج شده است .
1 .مقدار كم سلول ها در نمونه ي اوليه
راه حل مناسب جهت رفع آن : استخراج DNA را با نمونه غليظ تري از خون و يا از بافي كوت انجام مي دهیم .
2.لیز سلولی ضعیف به سه دلیل عمده اتفاق می افتد:
الف) کم بودن فعالیت پروتئیناز K
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و از پروتئیناز K تازه و یا از استوک ان استفاده کنید.
ب) میکس ناکافی نمونه با BG
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و نمونه با BG را کاملا میکس کنید .
پ) ناکافی بودن زمان انکوباسیون
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و زمان انکوباسیون را طولانی تر کنید.
3. اضافه نکردن اتانول به نمونه قبل از بردن روی ستون
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
4 .تهیه نادرست wash buffer که معمولا به دو دلیل زیر میباشد:
الف) در ابتدا اتانول به wash buffer اضافه نشده است.
اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 % به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
ب) حجم و درصد اتانول اضافه شده در ابتدامناسب نبوده است.
اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 % به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
5 .ناکارامد بودن الوشن بافر که معمولا به دو دلیل زیر میباشد :
الف) پ هاش اب (ddH2o) برای الوشن اسیدی است.
اطمینان حاصل کنید که PH ddH2o بین 9.0-7.5 است. از الوشن بافر اماده استفاده کنید.
ب) الوشن بافر یا ddH2o بطور کامل جذب ستون نشده است .
بعد از اضافه کردن الوشن بافر یا ddH2o ، پس از 5 دقیقه ستونها را سانتریفیوژ کنید.
دومین نکته فنی که کاربر بعد از استفاده از کیت استخراج DNA از خون ممکن است با آن رو به رو شود ، رسوبات قهوه ای رنگ باقیمانده روی سطح ستون بعد از مرحله شستشو است که عمدتا به دلایل زیر است.
1 . لیز سلولی ضعیف به سه دلیل عمده ایجاد میشود :
الف) کم بودن فعالیت پروتئیناز K
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و از پروتئیناز K تازه و یا از استوک ان استفاده کنید.
ب) میکس ناکافی نمونه با BG
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و نمونه با BG را کاملا میکس کنید .
پ) ناکافی بودن زمان انکوباسیون
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و زمان انکوباسیون را طولانی تر کنید.
2.اضافه نکردن اتانول به نمونه قبل از بردن روی ستون
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
3 .تهیه نادرست wash buffer که معمولا به دو دلیل زیر میباشد:
الف) در ابتدا اتانول به wash buffer اضافه نشده است.
اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 % به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
ب) حجم و درصد اتانول اضافه شده در ابتدامناسب نبوده است.
اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 % به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
سومین موردی که کاربر ممکن است در حین استفاده از کیت استخراج DNA از خون با آن برخورد کند بسته بودن ستون است.
بسته بودن ستون در فرآیند استخراج DNA از خون به سه دلیل زیر میباشد:
1 .خون حاوی لخته بوده است.
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.نمونه خون حاوی انتی کواگولانت را برای پیشگیری از لخته خوب میکس کنید.
2 . ویسکوزیته نمونه بالا است.
حجم نمونه را کم کنید.
3 . کم بودن فعالیت پروتئیناز K
از پروتئیناز K تازه و یا از استوک ان استفاده کنید و پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید. پروتئیناز K را مستقیما به بافر BG اضافه نکنید.
چهارمین موردی که کاربر ممکن است در حین استفاده از کیت استخراج DNA از خون با آن رو به رو شود:
پایین بودن OD 260/280 در نمونه استخراج شده است.
1 . لیز سلولی ضعیف که به سه دلیل عمده زیر اتفاق می افتد :
الف) کم بودن فعالیت پروتئیناز K
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و از پروتئیناز K تازه و یا از استوک ان استفاده کنید.
ب) میکس ناکافی نمونه با BG
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و نمونه با BG را کاملا میکس کنید .
پ) ناکافی بودن زمان انکوباسیون
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و زمان انکوباسیون را طولانی تر کنید.
2.اضافه نکردن اتانول به نمونه قبل از بردن روی ستون
پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
3 .تهیه نادرست wash buffer که معمولا به دو دلیل زیر میباشد:
الف) در ابتدا اتانول به wash buffer اضافه نشده است.
اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 % به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
ب) حجم و درصد اتانول اضافه شده در ابتدامناسب نبوده است.
اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 % به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.
4 . DNA استخراج شده contamination دارد.
هنگام ریختن نمونه و بافر اطراف ستون مرطوب نشود.
مورد بعدی که ممکن است کاربر را درگیر کند:
بالا بودن OD 260/280 میباشد که به دو دلیل زیر است:
- وجود مقدار زیاد RNA در DNA استخراج شده
مرحله 4 استخراج را برای حذف RNA بررسی و مرور کنید.
- بدون اضافه کردن RNase ، بافر BG اضافه شود.
اطمینان حاصل کنید کهRNase A در مرحله انتخابی مرحله RNase ، قبل از اضافه کردن BG اضافه کرده ایم.
و در اخر ، مشکل فنی Degradation نمونه استخراج شده میباشد که برای رفع به یکی از دو روش زیر اقدام کنید:
- نمونه قدیمی است.
همیشه از نمونه تازه یا نمونه استوک برای استخراج DNA استفاده شود.
- بافر ژل الکتروفورز حاوی DNase است.
از بافر تازه برای run کردن استفاده کنید.
