استخراج DNA از سلول

همان طور که می دانید علم زیست‌شناسی  از علوم باستانی مورد توجه انسان بوده ولی پیدایش شاخه ای تحت عنوان ژنتیک از صد سال پیش منجر به دگرگونی و انقلابی بزرگ در علم زیست شناسی شده است . آغاز این انقلاب در سده ی هجدهم توسط گروهی از محققان و پژوهشگران زمان وقت بود که بر آن شدند به بررسی و مطالعه ی  جابه جایی و انتقال بعضی صفات و ویژگی ها از نسلی به نسل دیگر بپردازند که امروزه این فرایند انتقال صفات ، ویژگی های ارثی خوانده می شود . در حقیقت علم ژنتیک ، آگاهی لازم جهت پی بردن به همانندی و ناهمانندی دو موجود زنده را نمایان می سازد. همچنین پژوهشگر با این علوم قادر است علت و چگونگی یک سری از شباهت ها و تفاوت ها در جامعه ی انسانی ، گیاهی و جانوری را بررسی و مطالعه کند.

اگر بخواهیم به طور خلاصه به بررسی این علم بپردازیم ، لازم است بدانید که همه ی پژوهش ها ، مطالعات و بررسی ها فقط از روی تفاوت ها و داده های ماده ی وراثتی درون سلولی میسر است . با حرکت و ارتقا روزافزون علوم ژنتیک ، روشهای بررسی ماده ژنتیکی ( اسیدنوکلئیک ) نیز به مراتب آسان تر  شد. محققان و دانشمندان با طراحی کیت های استخراج  DNA ، مسیر مطالعه و بررسی را کوتاه تر کردند.

استخراج DNA از سلول

در حال حاضر برای استخراج DNA از سلول ، پژوهشگر ایرانی می تواند از دو نوع کیت استخراج DNA از خون و یا کیت استخراج DNA بافت موجود در شرکت یکتاتجهیزآزما استفاده کند. هر دو محصول از کمپانی Favorgen تایوان بوده و شرکت یکتاتجهیزآزما نماینده انحصاری این کمپانی در ایران می باشد .

کیت استخراج DNA  از خون سازگار با نمونه های خون کامل ، سرم ، پلاسما ، ترشحات بدن و سلول کشت داده شده می باشد  و کیت استخراج DNA از بافت سازگار با انواع نمونه های سلول حیوانی ، بافت حیوانی ، خون ، باکتری ، بافت پارافینه ، مخمر و قارچ است . همچنین  کاربری کیت استخراج DNA از بافت بسیار وسیع بوده و با استفاده از آن و دستورالعمل های ویژه که در وبسایت آپلود شده است ، کاربر قادر است فرایند استخراج DNA از دیگر نمونه های سوآب ، شیر ، بزاق  و اسپرم انجام دهد . بنابراین هر دو کیت برای دستیابی به محصول DNA با غلظت و خلوص بالا از سلول کاربرد و کارایی دارد.

ساختار سلول و اندامک های سلولی

در ابتدا به توضیح کوتاهی درباره ساختار سلول ، انواع آن و اندامک های سلولی می پردازیم .

سلول ها اصلی ترین واحد بدن موجودات زنده هستند که ساختار کلی بدن را می سازند . در بدن انسان میلیاردها سلول با  راندمان و کارکرد های متفاوت وجود دارد . هر بخش از سلول ها وظایف و کارکرد خاص خود را دارد و برای حیات به مواد غذایی  نیاز دارند . برخی از موجودات فقط از یک سلول تشکیل شده اند که تک سلولی نام دارند مانند  باکتری ها و یا پروتوزوآ . جالب است بدانید که در موجودات  تک سلولی  سایز و ابعاد سلول  بعلت اینکه تمام اطلاعات ژنتیکی را عهده دار است ، بزرگ می باشد ولی در مقایسه ابعاد سلول در موجودات پرسلولی بسیار کوچک است و فقط  به وسیله ی میکروسکوپ‌های نوری قابل رویت هستند .

سلول ها توسط غشای سلولی از هم تفکیک می شوند  و درون هر یک از آن ها ، اندامک هایی وجود دارد که هر یک وظیفه و نقش خاص خود را دارند که از این وظایف و عملکرد اندامک ها می توان به تولید پروتئین ، تولید انرژی و یا پردازش مواد شیمیایی اشاره کرد .

از مهمترین این اندامک ها ، می توان به هسته اشاره کرد که تقریبا تمامی اطلاعات ژنتیکی را در خود جای داده است .

کدهای ژنتیکی در غالب سیگنال از هسته به دیگر اندامک ها ارسال می شود .

اندامک های سلولی به سه بخش تقسیم می شوند : برخی  فاقد غشا هستند مانند ریبوزوم ها و در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی به یک حالت یکسان وجود دارند . برخی اندامک ها غشای تک لایه دارند. این اندامک ها در سلول های یوکاریوتی جانوری و گیاهی هستند . برخی دیگر از اندامک غشای دولایه ای دارند . اندامک هایی مانند هسته ، کلروپلاست و میتوکندری از این دسته هستند . این اندامک ها فقط در سلول های یوکاریوتی هستند.

اندامک های سلول های یوکاریوتی :

• سیتوپلاسم که ماده ای ژله یی است که فضای داخلی سلول را در بر گرفته است و در واقع ماده زنده سلول که اندامک ها در آن شناور هستند را می سازد .
• اسکلت سلولی متشکل از فیبرهای بلند هستند که ساختار کلی سلول را تشکیل می دهند .
• شبکه اندوپلاسمی  نقش مهمی در پردازش مولکول های تولید شده در سلول را دارد و از لحاظ ساختاری به دو دسته ی  شبکه اندوپلاسمی نرم  و شبکه اندوپلاسمی زبر تقسیم می شوند .
• هسته سلولی که محل نگهداری اطلاعات ژنتیکی است.
• ریبوزوم کوچکترین اندامک سلولی است که جایگاه RNA  و پروتئین های خاص  می باشد .
• میتوکندری بزرگترین اندامک سلول محسوب می شود که حاوی DNA بوده و نقش این اندامک در فرایند تنفس و نقل و انتقال ATP حائز اهمیت است . بعلاوه این اندامک به واسطه دارا بودن ماده ژنتیکی ، توانایی کد کردن برخی از پروتئین ها را دارد .
• واکوئل تنها اندامک فاقد سیتوپلاسم است و محل جمع آوری آنزیم ها ، مواد غذایی و مواد زائد سلولی است .
• پلاستید ها تنها در سلول های گیاهی و بعضی جلبک ها هستند و دارای اطلاعات ژنتیکی هستند و براساس عملکردی که دارند انواع متفاوتی از پلاستید در سلول ها یافت می شود .  1) کلروپلاست  2) کروموپلاست 3) لوکوپلاست 4) آمیلوپلاست
• سانتریول ها به شکل استوانه در سلول های یوکاریوتی دیده می شوند و در تقسیم سلولی ، نقش جدا کردن کروموزوم ها را دارند .
• لیزوزوم ها محل نگهداری آنزیم ها هستند و به طور معمول آنزیم های اسیدی مانند هیدرولازها را با خود حمل می کنند .
• دستگاه گلژی که در سلول های یوکاریوتی دیده می شوند و نقش آن ها در تولید و ذخیره سازی مواد از شبکه آندوپلاسمی است .

بررسی مولکول DNA در سلول

یکی از مهم ترین پیشرفت ها و دستیابی های بزرگ جامعه ی بشریت ، شناسایی ، بررسی و کشف مولکول DNA  و ساختار آن بوده است . در حقیقت این کشف بزرگ منجر به مطالعه ، بررسی و انتقال صفات و اطلاعات وراثتی از نسلی به نسل دیگر شد .پیدایش نام گذاری اسیدنوکلئیک برای مولکول DNA توسط  یک دانشمند سوئیسی به نام فردیک میشر انجام شد . او در سال 1869 در روند مطالعه گلبول های سفید ، متوجه یک ماده جدید زیستی شد و آن را نوکلئین نام گذاری کرد  و چون خاصیت اسیدی ضعیفی داشت ، به آن اسیدنوکلئیک لقب داد .

مولکول DNA یا به عبارتی  دئوکسی‌ریبونوکلئیک اسید نام یک ترکیب شیمیایی است که حاوی تمامی اطلاعات ژنتیکی و وراثتی موجودات زنده می باشد .هر قسمت از DNA ( دی ان ای )مربوط به پروتوکل و یا کد تشکیل یک نوع پروتئین است که نتیجه آن منجر به تشکیل یک خصوصیت و یا ویژگی خاص می شود و ژن نام دارد .به عنوان نمونه سمتی از DNA که مسئول کدگذاری پروتئین انسولین است ، تحت عنوان ژن انسولین بررسی می شود .  تا به امروز حدود بیست تا سی هزار ژن در انسان کشف و بررسی شده است . ژن ها حدود سه درصد از DNA هر سلول را تشکیل می دهند و هنوز عملکرد نود و هفت درصد از مولکول DNA  شناسایی نشده است .

کیت استخراج DNA از سلول

در استخراج DNA از سلول و با استفاده از کیت استخراج DNA ، محقق به سهولت می تواند سلول های حیوانی را با استفاده از بافر لیز کننده و پروتئیناز K   لیز می شوند .

همان طور که گفته شد از دو محصول کیت استخراج DNA  از خون و کیت استخراج DNA از بافت می توان جهت استخراج DNA از سلول اقدام کرد .

کیت استخراج DNA از خون با متد ستونی بوده و غشای سیلیکایی در spin column (ستون چرخشی) از مرغوب ترین نوع خود در باز می باشد و در طی روند استخراج DNA از این کالا ، مقدار 20 تا 40 میکروگرم محصول DNA ژنومی استخراج می شود .

همچنین در کیت استخراج DNA از بافت ، گنجایش غشای سیلیکایی Spin column ( ستون چرخشی ) آن تا 60 میکروگرم ثبت شده است  و محصول DNA استخراج شده حدود 15 تا 35 میکروگرم در هر پرپ می باشد .

استخراج DNA با متد ستونی

استخراج DNA با متد ستونی در واقع یک متد استخراج فاز جامد برای دستیابی به محصول DNA با کیفیت و غلظت بالا و نیز مقرون به صرفه در زمان است .در این متد تحت یک شرایط ویژه بین اسیدنوکلئیک و فاز جامد سیلیس اتصال برقرار می شود .  پروسه استخراج DNA از سلول در روش ستونی به ترتیب اولویت با لیز سلول ها شروع می شود سپس اتصال اسیدنوکلئیک با غشای سیلیکایی انجام گرفته و با شستشوی اسیدنوکلئیک پایان می گیرد .

پس از دستیابی به محصول DNA ، محقق و یا پژوهشگر نتیجه فرایند استخراج را به روش کمی مورد بررسی قرار می دهد . برای بررسی و مطالعه کمیت و کیفیت محصول DNA استخراج شده از دستگاه نانودراپ ( Nano drop) استفاده می شود .

مراحل استخراج DNA از سلول

مراحل اساسی استخراج DNA صرف نظر از نوع سلول یکسان است.  این مراحل به ترتیب در ادامه آمده است.

• لیز سلولی

کلمه lysis به معنای جدا شدن است. در یک سلول، لیز زمانی اتفاق می افتد که غشاها از هم جدا شوند. سلول ها دارای یک غشای بیرونی به نام غشای سلولی هستند. آنها همچنین یک غشای داخلی دارند که DNA را احاطه کرده است. این غشای داخلی غشای هسته ای نامیده می شود. غشای سلولی از دو لایه لیپید (مولکول چربی) و پروتئین تشکیل شده است. لیز شیمیایی یکی از راه‌های جدا کردن غشای سلولی و غشای هسته است. در لیز شیمیایی، یک تکنسین آزمایشگاه یک ماده شوینده به سلول اضافه می کند. مواد شوینده مولکول های چربی را جدا می کند و باعث از بین رفتن غشاء می شود. لیز فیزیکی همچنین می تواند به شکستن غشای سلولی کمک کند. این شامل آسیاب یا مخلوط کردن سلول ها است که غشای آنها را می شکند. لیز شیمیایی گاهی با لیز فیزیکی ترکیب می شود.

• جداسازی DNA از پروتئین ها و سایر بقایای سلولی

پس از شکسته شدن سلول و غشای هسته، مولکول های چربی باید حذف شوند. یک تکنسین آزمایشگاه محلول نمک بسیار غلیظی را اضافه می کند. این باعث می شود مواد شوینده و سایر مواد زائد سلولی مانند پروتئین ها رسوب کنند. رسوب دادن به معنای تشکیل جامدی است که از محلول جدا می شود. DNA در محلول مایع حل شده باقی می ماند. می توان آن را با سانتریفیوژ از سایر اجزای سلولی جدا کرد. در سانتریفیوژ، محلول مایع با سرعت بالایی می چرخد ​​به طوری که رسوب به صورت گلوله در انتهای لوله جمع می شود. اما همچنان DNA به صورت حل شده باقی می ماند. از طرف دیگر، برخی از بقایای سلولی را می توان با فیلتر کردن نمونه حذف کرد.  DNA در هسته در اطراف پروتئین هایی به نام هیستون پیچیده شده است. این به سازماندهی DNA به کروموزوم کمک می کند. برای حذف پروتئین های هیستون، می توان یک پروتئاز اضافه کرد. پروتئاز آنزیمی است که پروتئین ها را تجزیه می کند.

• رسوب DNA با الکل

اکنون DNA باید از محلول مایع خارج شود. DNA در آب محلول است. یعنی می تواند در آب حل شود. اما در صورت وجود الکل و نمک محلول نیست. تکنسین های آزمایشگاهی می توانند اتانول یا ایزوپروپیل الکل را اضافه کنند تا DNA توده شده و یک رسوب سفید قابل مشاهده را تشکیل دهد. استفاده از الکل سرد بسیار مهم است زیرا باعث می شود مقدار بیشتری از DNA استخراج شود. اگر الکل خیلی گرم باشد، ممکن است باعث دناتوره شدن  یا تجزیه DNA شود. در طول سانتریفیوژ، DNA به یک شکل یک توده متراکم می شود. هنگامی که الکل حذف می شود، DNA نسبتاً خالص باقی می ماند.

• شستشو (پاکسازی DNA) :

در این مرحله می توان برای اینکه DNA خالص تر شود ،نمونه را شستشو و پاکسازی کرد و در نهایت در مقداری بافر حل نمود.

مراحل گفته شده اساس استخراج در هر نوع استخراجی می باشند. در این روش دستی از حلال‌های آلی خطرناک استفاده میشود، نسبتاً زمان‌بر است و فنل یا کلروفرم باقی‌مانده ممکن است بر کاربردهای پایین دستی مانند PCR تأثیر بگذارد. بنابراین کیت های تجاری به دلیل افزایش سرعت، کیفیت و حذف مواد سمی و فنول و کلوروفورم از مسیر استخراج تهیه و به بازار عرضه شدند. این کیت های تجاری می توانند بر اساس تکنولوژی سیلیس، جداسازی مگنتی، فناوری تبادل آنیون و  غیره باشد.

تکنولوژی مبتنی بر سیلیس

فن آوری های مبتنی بر سیلیس به طور گسترده در کیت های فعلی استفاده می شود. DNA به طور خاص به غشاء / دانه / ذرات سیلیکا در حضور نمک های خاص و در PH مشخص جذب می شود. آلاینده های سلولی با مراحل شستشو حذف می شوند. آلاینده های سلولی با مراحل شستشو حذف می شوند. DNA در بافر کم نمک یا بافر شستشو شسته می شود. نمک های Chaotropic در بافرهای کیت گنجانده شده اند تا به دناتوره شدن پروتئین و استخراج DNA کمک کنند. این روش مقرون به صرفه است، روش ساده تر و سریع تری نسبت به استخراج آلی دارد .

پس از استخراج، DNA می تواند برای آنالیزهای مولکولی از جمله PCR، الکتروفورز، توالی یابی، انگشت نگاری و شبیه سازی استفاده شود.

سوالات متداول