کنترل کیفیت RNA استخراج‌شده؛ ۴ معیار مهم برای بررسی کیفیت RNA

استخراج RNA زمانی موفقیت‌آمیز محسوب نمی‌شود که فقط مقدار مناسبی RNA به دست آمده باشد. برای استفاده از RNA در آزمایش‌هایی مانند RT-PCR، Real-Time PCR، ساخت cDNA، بررسی بیان ژن، RNA-Seq و مطالعات ترنسکریپتومیکس باید کیفیت نمونه نیز ارزیابی شود.

کنترل کیفیت RNA به ما کمک می‌کند مشخص کنیم RNA استخراج‌شده از نظر مقدار، خلوص و سلامت در چه وضعیتی قرار دارد و آیا برای آزمایش موردنظر مناسب است یا خیر.

به‌طور کلی، چهار معیار مهم در بررسی کیفیت RNA عبارت‌اند از:

1. غلظت RNA
2. نسبت A260/A280
3. نسبت A260/A230
4. یکپارچگی RNA یا RNA Integrity

این معیارها اطلاعات متفاوتی ارائه می‌کنند. غلظت، مقدار RNA موجود در نمونه را نشان می‌دهد؛ A260/A280 و A260/A230 بیشتر برای بررسی خلوص و احتمال وجود برخی آلودگی‌ها کاربرد دارند و RNA Integrity مشخص می‌کند RNA تا چه اندازه سالم و تجزیه‌نشده باقی مانده است.

بنابراین ممکن است یک نمونه RNA مقدار مناسبی داشته باشد و از نظر شاخص‌های خلوص نیز وضعیت مطلوبی نشان دهد، اما به دلیل تخریب RNA برای آزمایش موردنظر مناسب نباشد.

۴ معیار کلیدی برای بررسی کیفیت RNA پس از استخراج

۱. غلظت RNA؛ چه مقدار RNA در اختیار داریم؟

اولین مرحله در کنترل کیفیت RNA، بررسی مقدار RNA استخراج‌شده است.

غلظت RNA نشان می‌دهد در حجم مشخصی از نمونه، چه مقدار RNA وجود دارد و آیا مقدار آن برای مرحله بعدی آزمایش کافی است یا خیر.

اندازه‌گیری غلظت معمولاً با ابزارهایی مانند NanoDrop، اسپکتروفتومتر یا Qubit انجام می‌شود. هر یک از این روش‌ها بر اساس اصول متفاوتی کار می‌کنند و انتخاب آن‌ها به نوع نمونه و دقت موردنیاز بستگی دارد.

آیا غلظت بالای RNA به معنی کیفیت بهتر است؟

خیر.

غلظت بالا به‌تنهایی نمی‌تواند کیفیت RNA را مشخص کند. ممکن است مقدار RNA یک نمونه زیاد باشد، اما بخشی از آن به دلیل تخریب یا وجود مواد همراه، برای کاربرد موردنظر مناسب نباشد.

در مقابل، ممکن است نمونه‌ای مقدار کمتری RNA داشته باشد اما از نظر خلوص و یکپارچگی در وضعیت مناسبی قرار گرفته باشد.

بنابراین:

غلظت RNA فقط مقدار نمونه را نشان می‌دهد، نه کیفیت کامل آن را.

این نکته یکی از مهم‌ترین اصول در تفسیر نتایج کنترل کیفیت RNA است.

NanoDrop یا Qubit؛ کدام روش برای اندازه‌گیری RNA بهتر است؟

NanoDrop یکی از ابزارهای رایج برای بررسی اولیه RNA است. این دستگاه علاوه بر تخمین مقدار RNA، اطلاعاتی درباره نسبت‌های جذب و خلوص نمونه نیز ارائه می‌دهد.

Qubit بر پایه فلورومتری کار می‌کند و برای اندازه‌گیری اختصاصی‌تر مقدار RNA بسیار کاربردی است؛ به‌خصوص زمانی که غلظت نمونه پایین باشد یا وجود ترکیبات دیگر احتمال ایجاد خطا در اندازه‌گیری جذب نوری را افزایش دهد.

بنابراین NanoDrop و Qubit الزاماً جایگزین یکدیگر نیستند.

می‌توان از NanoDrop برای یک بررسی اولیه غلظت و خلوص و از Qubit برای کمی‌سازی دقیق‌تر RNA استفاده کرد.

۲. نسبت A260/A280؛ بررسی یکی از شاخص‌های خلوص RNA

یکی از رایج‌ترین معیارها در کنترل کیفیت RNA، نسبت A260/A280 است.

این نسبت بر اساس مقایسه میزان جذب نمونه در طول موج‌های مشخص به دست می‌آید و می‌تواند اطلاعاتی درباره خلوص RNA و احتمال وجود برخی مواد همراه نمونه ارائه کند.

از آنجا که اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها رفتار جذب متفاوتی دارند، A260/A280 می‌تواند برای بررسی احتمال آلودگی‌هایی مانند پروتئین و برخی ترکیبات همراه RNA مفید باشد.

A260/A280 پایین چه معنایی دارد؟

اگر این نسبت پایین‌تر از محدوده مورد انتظار باشد، ممکن است احتمال وجود مواد مزاحم در نمونه بیشتر باشد.

برای مثال، باقی‌ماندن برخی ترکیبات حاصل از مرحله استخراج یا وجود پروتئین می‌تواند روی این نسبت اثر بگذارد.

با این حال، نباید فقط با دیدن یک مقدار نامناسب، نوع آلودگی را به‌طور قطعی مشخص کرد. شرایط استخراج، نوع محلول، نحوه اندازه‌گیری و سایر شاخص‌های کنترل کیفیت نیز باید در نظر گرفته شوند.

آیا A260/A280 مناسب به معنی RNA سالم است؟

خیر.

این نسبت بیشتر اطلاعاتی درباره خلوص RNA ارائه می‌دهد و نمی‌تواند مشخص کند RNA تا چه حد تخریب شده است.

در نتیجه ممکن است RNA از نظر A260/A280 مناسب باشد، اما از نظر Integrity کیفیت مطلوبی نداشته باشد.

۳. نسبت A260/A230؛ بررسی آلودگی‌های باقی‌مانده از استخراج

نسبت A260/A230 یکی دیگر از شاخص‌های مهم در ارزیابی خلوص RNA است.

این نسبت می‌تواند اطلاعات مکملی درباره وجود برخی مواد باقی‌مانده از مراحل استخراج و خالص‌سازی ارائه دهد.

در صورت وجود ترکیباتی مانند برخی نمک‌ها، مواد موجود در بافرهای استخراج، گوانیدین، فنول یا سایر ترکیبات آلی، الگوی جذب نمونه ممکن است تغییر کند و در نتیجه نسبت A260/A230 کاهش پیدا کند.

چرا A260/A230 اهمیت دارد؟

ممکن است یک نمونه از نظر A260/A280 وضعیت مناسبی داشته باشد، اما همچنان حاوی موادی باشد که از فرآیند استخراج باقی مانده‌اند.

این مواد در برخی شرایط می‌توانند روی واکنش‌های آنزیمی پایین‌دستی اثر بگذارند و باعث شوند RNA با وجود مقدار مناسب، در آزمایش‌هایی مانند Reverse Transcription یا PCR عملکرد مطلوبی نداشته باشد.

به همین دلیل، بررسی A260/A230 در کنار A260/A280 می‌تواند تصویر کامل‌تری از خلوص RNA ارائه دهد.

تفاوت A260/A280 و A260/A230 چیست؟

هر دو نسبت برای بررسی خلوص RNA استفاده می‌شوند، اما اطلاعات کاملاً یکسانی ارائه نمی‌کنند.

A260/A280 بیشتر برای بررسی یکی از جنبه‌های خلوص و احتمال برخی آلودگی‌های مرتبط با پروتئین و مواد همراه نمونه مفید است.

A260/A230 بیشتر می‌تواند وجود برخی مواد باقی‌مانده از فرآیند استخراج و خالص‌سازی را آشکار کند.

بنابراین بهتر است این دو شاخص همیشه در کنار یکدیگر تفسیر شوند.

از طرف دیگر، هیچ‌کدام از این دو نسبت به‌تنهایی نمی‌توانند سلامت ساختاری RNA را مشخص کنند.

۴. یکپارچگی RNA یا RNA Integrity؛ آیا RNA سالم باقی مانده است؟

چهارمین معیار و یکی از مهم‌ترین بخش‌های کنترل کیفیت RNA، یکپارچگی یا Integrity RNA است.

در این مرحله سؤال اصلی این است:

آیا RNA استخراج‌شده هنوز سالم و یکپارچه است یا در اثر تخریب به قطعات کوچک‌تر تبدیل شده است؟

RNA نسبت به فعالیت RNase بسیار حساس است و در طول نمونه‌برداری، انتقال، استخراج یا نگهداری می‌تواند دچار تخریب شود.

به همین دلیل، ممکن است یک نمونه:

• مقدار RNA مناسبی داشته باشد؛
• از نظر A260/A280 وضعیت قابل قبولی داشته باشد؛
• از نظر A260/A230 نیز مناسب باشد؛

اما همچنان RNA آن به مقدار قابل‌توجهی تخریب شده باشد.

این همان تفاوت مهم میان خلوص RNA و یکپارچگی RNA است.

چه عواملی باعث تخریب RNA می‌شوند؟

تخریب RNA می‌تواند از مراحل پیش از استخراج آغاز شود و تا زمان نگهداری نمونه ادامه پیدا کند.

مهم‌ترین عوامل مؤثر عبارت‌اند از:

• فعالیت و آلودگی با RNase
• تأخیر در پردازش نمونه
• نگهداری نامناسب نمونه
• تغییرات نامناسب دما
• چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب
• تماس غیرضروری نمونه با محیط
• استفاده از مواد یا تجهیزات نامناسب
• طولانی شدن فرآیند استخراج
• عدم رعایت شرایط مناسب برای کار با RNA

به همین دلیل، حفظ کیفیت RNA فقط به مرحله بعد از استخراج مربوط نیست و باید از زمان جمع‌آوری نمونه مورد توجه قرار گیرد.

چگونه یکپارچگی RNA را بررسی کنیم؟

برای بررسی RNA Integrity روش‌های مختلفی وجود دارد و انتخاب روش به نوع نمونه و کاربرد نهایی بستگی دارد.

بررسی RNA روی ژل آگارز

یکی از روش‌های کلاسیک، مشاهده RNA روی ژل آگارز است.

در RNA نسبتاً سالم، الگوی RNA ریبوزومی واضح‌تر است، در حالی که در نمونه‌های تخریب‌شده، این الگو کاهش پیدا می‌کند و RNA بیشتر به شکل smear دیده می‌شود.

این روش برای یک ارزیابی اولیه مفید است، اما نتیجه آن بیشتر کیفی است و مانند دستگاه‌های آنالیز خودکار، یک امتیاز استاندارد برای Integrity ارائه نمی‌کند.

Bioanalyzer و RIN

برای ارزیابی دقیق‌تر RNA می‌توان از سیستم‌هایی مانند Agilent Bioanalyzer استفاده کرد.

این دستگاه با تحلیل الگوی RNA، شاخصی به نام RIN یا RNA Integrity Number ارائه می‌دهد.

در حالت کلی، RIN بالاتر نشان‌دهنده RNA با یکپارچگی بهتر و تخریب کمتر است.

نکته مهم این است که RIN نباید به‌عنوان یک عدد مطلق برای رد یا پذیرش همه نمونه‌ها در نظر گرفته شود. مناسب بودن RNA به نوع آزمایش و کاربرد نهایی آن بستگی دارد.

TapeStation و RINe

در برخی سیستم‌های TapeStation شاخصی مانند RINe برای ارزیابی Integrity RNA ارائه می‌شود.

RIN و RINe هر دو در چارچوب بررسی یکپارچگی RNA قرار می‌گیرند و به پلتفرم مورد استفاده وابسته‌اند.

RIN برای چه کاربردهایی اهمیت بیشتری دارد؟

RIN به‌خصوص زمانی اهمیت پیدا می‌کند که کیفیت و یکپارچگی RNA اثر قابل‌توجهی بر آزمایش نهایی داشته باشد.

در پروژه‌هایی مانند RNA-Seq، مطالعات ترنسکریپتومیکس و برخی آزمایش‌های حساس بیان ژن، بررسی Integrity می‌تواند نقش مهمی در انتخاب نمونه مناسب داشته باشد.

در مقابل، برای بعضی آزمایش‌های qPCR ممکن است نمونه‌ای با مقدار مشخصی تخریب همچنان قابل استفاده باشد.

به همین دلیل، یک RIN مشخص را نباید به‌عنوان معیار جهانی برای تمام آزمایش‌های مولکولی در نظر گرفت.

آیا RNA با Integrity پایین همیشه غیرقابل استفاده است؟

خیر.

کاهش Integrity به معنی تخریب RNA است، اما اینکه این تخریب چقدر مشکل‌ساز است به کاربرد نهایی بستگی دارد.

برای مثال، نیاز یک آزمایش qPCR لزوماً با نیاز یک پروژه RNA-Seq یکسان نیست.

در نتیجه باید بررسی شود که RNA موجود برای همان آزمایش و همان هدف پژوهشی کیفیت کافی دارد یا خیر.

این رویکرد باعث می‌شود تصمیم‌گیری بر اساس کاربرد واقعی نمونه انجام شود، نه صرفاً یک عدد منفرد.

DV200 چیست؟

در برخی نمونه‌های شدیداً تخریب‌شده، به‌خصوص نمونه‌های FFPE، استفاده از RIN به‌تنهایی ممکن است تصویر کاملی از وضعیت RNA ارائه نکند.

در چنین شرایطی شاخص DV200 می‌تواند مفید باشد.

DV200 نشان می‌دهد چه سهمی از RNA موجود در نمونه در قطعات نسبتاً بلند باقی مانده است و به همین دلیل در ارزیابی RNAهای تخریب‌شده و برخی workflowهای sequencing کاربرد دارد.

این شاخص به‌ویژه برای نمونه‌های FFPE اهمیت دارد؛ زیرا RNA موجود در این نمونه‌ها معمولاً پیش از مرحله استخراج نیز دچار fragmentation شده است.

بنابراین در نمونه‌های تخریب‌شده، بهتر است کیفیت RNA بر اساس ترکیبی از شاخص‌ها ارزیابی شود و فقط به RIN تکیه نشود.

آیا خلوص خوب به معنی RNA سالم است؟

خیر.

این یکی از مهم‌ترین نکات در کنترل کیفیت RNA استخراج‌شده است.

فرض کنید یک نمونه از نظر A260/A280 و A260/A230 وضعیت مناسبی دارد. این نتیجه نشان می‌دهد از نظر برخی شاخص‌های خلوص، نمونه شرایط مطلوبی دارد.

اما اگر RNA در اثر RNase یا شرایط نامناسب نگهداری تخریب شده باشد، همچنان ممکن است از نظر Integrity کیفیت مناسبی نداشته باشد.

بنابراین:

Purity و Integrity دو ویژگی متفاوت RNA هستند.

برای ارزیابی کامل، هر دو باید متناسب با کاربرد موردنظر بررسی شوند.

کنترل کیفیت RNA برای RT-PCR و Real-Time PCR

در RT-PCR و Real-Time PCR، RNA به‌عنوان ماده اولیه برای ساخت cDNA استفاده می‌شود؛ بنابراین کیفیت RNA می‌تواند روی نتیجه نهایی آزمایش اثر بگذارد.

وجود مواد مهارکننده ممکن است فعالیت آنزیم‌ها را مختل کند و آلودگی DNA نیز می‌تواند باعث ایجاد سیگنال ناخواسته شود.

از طرف دیگر، تخریب RNA می‌تواند کیفیت الگوی مورد استفاده برای Reverse Transcription را کاهش دهد.

بنابراین برای qPCR بهتر است فقط به غلظت RNA اکتفا نشود و مقدار، خلوص، آلودگی DNA و Integrity متناسب با طراحی آزمایش در نظر گرفته شوند.

کنترل کیفیت RNA برای RNA-Seq

در RNA-Seq، کیفیت RNA ورودی اهمیت زیادی دارد؛ زیرا وضعیت RNA می‌تواند بر مراحل آماده‌سازی library و کیفیت داده‌های حاصل از sequencing اثر بگذارد.

در این کاربرد، بررسی Integrity معمولاً اهمیت بیشتری پیدا می‌کند و بسته به نوع نمونه و روش آماده‌سازی library ممکن است معیارهای متفاوتی برای پذیرش RNA وجود داشته باشد.

در نمونه‌های تخریب‌شده مانند FFPE نیز بهتر است علاوه بر RIN، شاخص‌هایی مانند DV200 و سایر معیارهای توصیه‌شده توسط مرکز sequencing بررسی شوند.

بنابراین همیشه باید استاندارد QC متناسب با نوع RNA و روش sequencing انتخاب شود.

آلودگی DNA در RNA استخراج‌شده

در کنار بررسی مقدار، خلوص و Integrity، وجود DNA ژنومی نیز باید مورد توجه قرار گیرد.

گاهی RNA از نظر شاخص‌های جذب نوری وضعیت مناسبی دارد، اما مقدار کمی DNA همراه آن باقی مانده است.

این آلودگی در آزمایش‌هایی مانند RT-PCR و qPCR می‌تواند باعث ایجاد نتایج ناخواسته شود.

در صورت نیاز، می‌توان از DNase treatment برای حذف DNA و از کنترل‌هایی مانند No-RT برای بررسی تأثیر DNA ژنومی استفاده کرد.

بنابراین کنترل کیفیت RNA فقط به اندازه‌گیری با NanoDrop محدود نیست.

چگونه کیفیت RNA را بعد از استخراج ارزیابی کنیم؟

یک روند ساده و کاربردی می‌تواند شامل مراحل زیر باشد:

ابتدا مقدار RNA بررسی شود.

سپس خلوص RNA با استفاده از شاخص‌های مناسب ارزیابی شود.

در مرحله بعد، در صورت نیاز یکپارچگی RNA با روش‌هایی مانند ژل آگارز، Bioanalyzer یا TapeStation بررسی شود.

در نهایت، تمام نتایج باید در کنار کاربرد نهایی RNA تفسیر شوند.

برای مثال، معیار موردنیاز برای RNA مورد استفاده در qPCR الزاماً با RNA مورد استفاده در RNA-Seq یکسان نیست.

جدول جمع‌بندی کنترل کیفیت RNA

جمع‌بندی؛ چهار معیار مهم برای کنترل کیفیت RNA

برای بررسی کیفیت RNA استخراج‌شده، بهتر است به جای تمرکز روی یک عدد، مجموعه‌ای از معیارها در کنار یکدیگر بررسی شوند.

غلظت RNA مشخص می‌کند چه مقدار RNA در اختیار داریم.

A260/A280 یکی از شاخص‌های مهم برای بررسی خلوص RNA است.

A260/A230 اطلاعات مکملی درباره احتمال وجود برخی مواد باقی‌مانده از فرآیند استخراج ارائه می‌دهد.

RNA Integrity مشخص می‌کند RNA تا چه اندازه سالم، یکپارچه و کم‌تخریب باقی مانده است.

در نتیجه، ممکن است یک نمونه از نظر مقدار و خلوص وضعیت مطلوبی داشته باشد اما به دلیل تخریب RNA برای یک کاربرد خاص مناسب نباشد.

بهترین روش برای کنترل کیفیت RNA این است که غلظت، خلوص و Integrity در کنار یکدیگر و بر اساس کاربرد نهایی RNA تفسیر شوند.

به بیان ساده:

مقدار RNA مهم است، اما کافی نیست.

خلوص RNA مهم است، اما کافی نیست.

سلامت و یکپارچگی RNA نیز باید متناسب با هدف آزمایش بررسی شود.

سوالات متداول درباره کنترل کیفیت RNA

کنترل کیفیت RNA چیست؟

کنترل کیفیت RNA مجموعه‌ای از بررسی‌ها برای ارزیابی مقدار، خلوص و یکپارچگی RNA استخراج‌شده و تعیین مناسب بودن آن برای آزمایش‌های بعدی است.

مهم‌ترین معیارهای کنترل کیفیت RNA کدام‌اند؟

چهار معیار اصلی شامل غلظت RNA، A260/A280، A260/A230 و RNA Integrity هستند.

آیا غلظت بالای RNA به معنی کیفیت خوب است؟

خیر. غلظت فقط مقدار RNA را نشان می‌دهد و به‌تنهایی درباره خلوص یا سلامت RNA اطلاعات کاملی ارائه نمی‌کند.

A260/A280 در RNA چه چیزی را نشان می‌دهد؟

این نسبت یکی از شاخص‌های خلوص RNA است و می‌تواند برای بررسی احتمال وجود برخی آلودگی‌ها مورد استفاده قرار گیرد.

A260/A230 در RNA چه چیزی را نشان می‌دهد؟

A260/A230 یک شاخص مکمل برای ارزیابی خلوص است و می‌تواند درباره وجود برخی مواد باقی‌مانده از فرآیند استخراج اطلاعات بدهد.

RNA Integrity چیست؟

RNA Integrity به میزان سالم‌بودن و تجزیه‌نشدن مولکول‌های RNA اشاره دارد.

RIN چیست؟

RIN یا RNA Integrity Number یک شاخص عددی برای ارزیابی یکپارچگی RNA است که در سیستم‌هایی مانند Bioanalyzer ارائه می‌شود.

آیا NanoDrop برای بررسی سلامت RNA کافی است؟

خیر. NanoDrop برای ارزیابی مقدار و برخی شاخص‌های خلوص بسیار مفید است، اما برای بررسی مستقیم Integrity RNA کافی نیست.

آیا RNA با Integrity پایین قابل استفاده است؟

بسته به کاربرد ممکن است قابل استفاده باشد. معیار موردنیاز برای qPCR، RNA-Seq و سایر آزمایش‌ها الزاماً یکسان نیست.

چرا با وجود خلوص مناسب، RNA کیفیت خوبی ندارد؟

زیرا خلوص و Integrity دو ویژگی متفاوت هستند. ممکن است RNA از نظر آلودگی شیمیایی وضعیت مناسبی داشته باشد اما به دلیل تخریب، سلامت ساختاری کافی نداشته باشد.