ارتباط مستقیم با کارشناس فروش
محاسبه ΔCt و ΔΔCt برای بررسی بیان ژن در Real-Time PCR
محاسبه دلتا Ct و دلتا دلتا Ct (ΔCt و ΔΔCt) برای بررسی بیان ژن در Real-Time PCR
تحلیل نتایج Real-Time PCR (qPCR) یکی از روشهای پرکاربرد برای بررسی بیان ژن است. دستگاه qPCR معمولاً پس از پایان واکنش، مقدار Ct یا Cq را برای هر نمونه گزارش میکند؛ اما مقایسه مستقیم Ctها بهتنهایی برای تعیین میزان تغییر بیان ژن کافی نیست.
برای تحلیل مناسب، ابتدا Ct ژن هدف نسبت به یک ژن مرجع (Reference Gene) نرمال میشود و سپس نمونه مورد آزمایش با یک نمونه کنترل یا Calibrator مقایسه میشود.
در این مقاله، محاسبه دلتا Ct و دلتا دلتا Ct، روش 2^-ΔΔCt، محاسبه Fold Change و نحوه تفسیر افزایش یا کاهش بیان ژن را با مثال توضیح میدهیم.
روش ΔΔCt یا Comparative Ct Method یکی از روشهای رایج برای بررسی بیان نسبی ژن است. این روش توسط Livak و Schmittgen معرفی شد و برای مقایسه تغییرات نسبی بیان ژن در qPCR کاربرد گستردهای دارد.
Ct یا Cq در Real-Time PCR چیست؟
در Real-Time PCR، دستگاه افزایش سیگنال فلورسانس را در طول چرخههای PCR ثبت میکند. Ct (Cycle Threshold) یا Cq (Quantification Cycle) چرخهای است که سیگنال از یک آستانه مشخص عبور میکند.
بهطور ساده:
- Ct پایینتر → مقدار اولیه هدف بیشتر
- Ct بالاتر → مقدار اولیه هدف کمتر
با این حال، مقدار Ct میتواند تحت تأثیر عواملی مانند مقدار و کیفیت RNA، مرحله Reverse Transcription و مقدار ورودی نمونه قرار گیرد. به همین دلیل برای بررسی بیان نسبی ژن، Ct ژن هدف نسبت به ژن مرجع نرمال میشود.
قبل از تحلیل نتایج Real-Time PCR چه مواردی باید بررسی شود؟
قبل از شروع محاسبه دلتا Ct و دلتا دلتا Ct، بهتر است کیفیت واکنش و دادههای qPCR بررسی شود.
بررسی اختصاصیت واکنش با منحنی ذوب (Melting Curve)
Melting Curve برای بررسی اختصاصیت محصول PCR استفاده میشود. شکل و تعداد پیکهای منحنی ذوب میتواند به شناسایی محصول هدف و محصولات غیراختصاصی مانند Primer Dimer کمک کند.
فیلم آموزشی شرح کامل منحنی ذوب (Melting Curve) در Real-Time PCR
در یک واکنش اختصاصی معمولاً یک پیک مشخص در دمای ذوب مورد انتظار مشاهده میشود.
بررسی راندمان PCR
راندمان PCR یکی از عوامل مهم در تفسیر دادههای qPCR است. یکی از روشهای بررسی آن، استفاده از Standard Curve و رقتهای متوالی از الگو است.
فرمول محاسبه راندمان:
Efficiency = (10^(-1/slope) − 1) × 100
برای راندمان نزدیک به 100 درصد، شیب منحنی استاندارد تقریباً 3.32- است.
اگر راندمان ژن هدف و ژن مرجع تفاوت قابلتوجهی داشته باشد، استفاده ساده از 2^-ΔΔCt میتواند مناسب نباشد و باید روشهای اصلاحشده در نظر گرفته شوند.
انتخاب ژن مرجع مناسب
ژن مرجع برای نرمالسازی بیان ژن هدف استفاده میشود. ژنهایی مانند GAPDH، ACTB و 18S rRNA در مطالعات مختلف استفاده شدهاند، اما هیچ ژن مرجعی را نمیتوان بدون بررسی برای تمام آزمایشها مناسب دانست.
پایداری ژن مرجع باید در شرایط همان آزمایش بررسی شود؛ زیرا تغییر بیان ژن مرجع میتواند نتیجه ΔCt و در نهایت ΔΔCt را تحت تأثیر قرار دهد.
محاسبه دلتا Ct (ΔCt) چیست؟
ΔCt یا Delta Ct اختلاف بین Ct ژن هدف و Ct ژن مرجع در یک نمونه است.
ΔCt = Ct ژن هدف − Ct ژن مرجع
برای مثال، اگر:
- Ct ژن هدف = 24
- Ct ژن مرجع = 20
باشد:
ΔCt = 24 − 20 = 4
بنابراین مقدار دلتا Ct برابر 4 است.
چرا ΔCt محاسبه میشود؟
هدف از محاسبه ΔCt، نرمالسازی مقدار ژن هدف نسبت به ژن مرجع است. به این ترتیب، مقایسه نمونهها نسبت به یک مرجع داخلی انجام میشود.
محاسبه دلتا دلتا Ct (ΔΔCt) چیست؟
پس از محاسبه ΔCt برای نمونهها، میتوان نمونه آزمایشی را با نمونه کنترل مقایسه کرد.
اختلاف ΔCt نمونه آزمایشی و نمونه کنترل، ΔΔCt یا Delta Delta Ct نام دارد.
ΔΔCt = ΔCt Sample − ΔCt Control
نمونه کنترل بهعنوان Calibrator یا نمونه مرجع در نظر گرفته میشود.
روش محاسبه دلتا دلتا Ct به زبان ساده
برای محاسبه دلتا دلتا Ct چهار مرحله اصلی وجود دارد:
- Ct ژن هدف و ژن مرجع را برای هر نمونه مشخص کنید.
- ΔCt هر نمونه را محاسبه کنید.
- نمونه کنترل یا Calibrator را تعیین کنید.
- ΔCt نمونه آزمایشی را از ΔCt نمونه کنترل کم کنید.
فرمول کلی:
ΔΔCt = (Ct Target − Ct Reference)Sample − (Ct Target − Ct Reference)Control
محاسبه 2^-ΔΔCt و Fold Change
پس از بهدستآوردن ΔΔCt، میتوان مقدار تغییر نسبی بیان ژن را محاسبه کرد.
فرمول:
Fold Change = 2^-ΔΔCt
این روش همان Comparative Ct Method است که برای تحلیل بیان نسبی ژن در qPCR استفاده میشود.
تفسیر Fold Change
| Fold Change | تفسیر |
|---|---|
| 1 | تغییر نسبی مشاهده نمیشود |
| بیشتر از 1 | افزایش بیان ژن |
| کمتر از 1 | کاهش بیان ژن |
| 2 | حدود 2 برابر افزایش |
| 0.5 | رسیدن بیان به نصف کنترل |
| 4 | حدود 4 برابر افزایش |
| 0.25 | رسیدن بیان به یکچهارم کنترل |
برای مثال اگر:
ΔΔCt = -1
باشد:
2^-(-1) = 2
بنابراین بیان نسبی ژن حدود 2 برابر نمونه کنترل است.
اگر:
ΔΔCt = 1
باشد:
2^-1 = 0.5
یعنی مقدار بیان ژن به حدود 50 درصد کنترل رسیده است.
مثال کامل محاسبه دلتا Ct، دلتا دلتا Ct و Fold Change
فرض کنید میخواهیم بیان یک ژن هدف را در دو گروه Control و Treatment مقایسه کنیم.
| نمونه | Ct ژن هدف | Ct ژن مرجع |
|---|---|---|
| Control | 25 | 20 |
| Treatment | 22 | 20 |
مرحله اول: محاسبه ΔCt کنترل
ΔCt Control = 25 − 20 = 5
مرحله دوم: محاسبه ΔCt تیمار
ΔCt Treatment = 22 − 20 = 2
مرحله سوم: محاسبه ΔΔCt
ΔΔCt = 2 − 5 = -3
مرحله چهارم: محاسبه Fold Change
Fold Change = 2^-(-3) = 2³ = 8
بنابراین در این مثال، بیان نسبی ژن هدف در گروه Treatment حدود 8 برابر بیشتر از Control است.
برای آشنایی بیشتر با مفهوم Ct، تفسیر مقدار Ct و عوامل مؤثر بر آن، میتوانید مقاله نتایج Real-Time PCR بر اساس Ct Value را مطالعه کنید.
اگر دلتا دلتا Ct (ΔΔCt) مثبت باشد چه معنایی دارد؟
علامت ΔΔCt در تفسیر نتیجه اهمیت دارد.
برای مثال اگر:
ΔΔCt = +2
باشد:
Fold Change = 2^-2 = 0.25
یعنی بیان ژن به حدود 25 درصد مقدار کنترل رسیده است.
بنابراین مقدار مثبت ΔΔCt در این مثال با کاهش بیان ژن همراه است.
تفاوت دلتا Ct و دلتا دلتا Ct چیست؟
تفاوت این دو مفهوم را میتوان به شکل ساده زیر بیان کرد:
- ΔCt: نرمالسازی ژن هدف نسبت به ژن مرجع در یک نمونه
- ΔΔCt: مقایسه ΔCt نمونه آزمایشی با نمونه کنترل
- 2^-ΔΔCt: محاسبه تغییر نسبی بیان یا Fold Change
مسیر کلی تحلیل به این صورت است:
Ct → ΔCt → ΔΔCt → 2^-ΔΔCt → Fold Change → تفسیر بیان ژن
آیا همیشه فقط یک ژن مرجع کافی است؟
خیر. در بعضی آزمایشها استفاده از چند ژن مرجع میتواند نرمالسازی قابلاعتمادتری ایجاد کند، بهخصوص زمانی که پایداری یک ژن مرجع منفرد مشخص نباشد.
نکته مهم این است که ژن مرجع باید در شرایط آزمایش پایدار باشد و انتخاب آن نباید صرفاً بر اساس رایج بودن یک ژن انجام شود.
پیشنیازهای استفاده از روش 2^-ΔΔCt
فرمول 2^-ΔΔCt ساده و کاربردی است، اما به فرضهایی درباره راندمان تکثیر وابسته است. در روش کلاسیک، راندمان تکثیر ژن هدف و ژن مرجع باید مناسب و تا حد زیادی مشابه باشد.
اگر راندمان Assayها تفاوت قابلتوجهی داشته باشد، میتوان از روشهای Efficiency-Corrected مانند مدل Pfaffl یا سایر روشهای مناسب استفاده کرد.
بنابراین پیش از تفسیر نتایج، بررسی راندمان PCR، اختصاصیت واکنش، کیفیت RNA و cDNA و پایداری ژن مرجع اهمیت دارد.
تفاوت بیان نسبی و بیان مطلق ژن
بیان نسبی ژن
در بیان نسبی، مقدار ژن هدف نسبت به یک نمونه کنترل یا Calibrator مقایسه میشود.
ΔCt → ΔΔCt → 2^-ΔΔCt
این روش برای بسیاری از مطالعات مقایسهای بیان ژن کاربرد دارد.
بیان مطلق ژن
در Quantification مطلق، هدف تعیین مقدار یا تعداد کپی یک هدف با استفاده از استاندارد و منحنی استاندارد است.
بنابراین:
Relative Quantification ≠ Absolute Quantification
روش ΔΔCt برای تعیین مستقیم تعداد کپی مطلق ژن طراحی نشده است.
محاسبه بیان ژن با Excel
محاسبه دلتا Ct و دلتا دلتا Ct را میتوان بهسادگی در Excel انجام داد.
| Sample | Target Ct | Reference Ct | ΔCt | ΔΔCt | Fold Change |
|---|---|---|---|---|---|
| Control | 25 | 20 | 5 | 0 | 1 |
| Treatment | 22 | 20 | 2 | -3 | 8 |
فرمولها:
ΔCt = Target Ct - Reference Ct
ΔΔCt = Sample ΔCt - Control ΔCt
Fold Change = 2^(-ΔΔCt)
در Excel میتوان از تابع زیر نیز استفاده کرد:
=POWER(2,-ΔΔCt)
چگونه نتایج qPCR را در نمودار نشان دهیم؟
پس از محاسبه Fold Change، نتایج گروههای مختلف را میتوان در قالب نمودار Relative Expression نمایش داد.
معمولاً:
- محور افقی: گروههای آزمایشی
- محور عمودی: Fold Change یا Relative Expression
اگر Control برابر 1 در نظر گرفته شود، سایر گروهها نسبت به آن نمایش داده میشوند.
نکته مهم این است که Fold Change بهتنهایی نشاندهنده معناداری آماری نیست. برای نتیجهگیری آماری باید تکرارهای بیولوژیک، طراحی آزمایش و روش آماری مناسب در نظر گرفته شود.
Ct، ΔCt و Fold Change را چگونه گزارش کنیم؟
در گزارش نتایج qPCR بهتر است علاوه بر Fold Change، اطلاعات مربوط به ژن مرجع، روش نرمالسازی، تعداد تکرارهای بیولوژیک و روش آماری نیز مشخص باشد.
هدف از راهنماهای گزارشدهی qPCR مانند MIQE نیز افزایش شفافیت و قابلیت تکرارپذیری آزمایشهاست.
خطاهای رایج در تحلیل دلتا دلتا Ct
مقایسه مستقیم Ct دو گروه
مقایسه مستقیم Ct دو گروه بهتنهایی برای تعیین بیان نسبی کافی نیست. ابتدا باید دادهها نسبت به ژن مرجع نرمال شوند.
انتخاب ژن مرجع بدون اعتبارسنجی
اگر ژن مرجع در شرایط آزمایش تغییر کند، نتیجه ΔCt و ΔΔCt نیز میتواند دچار خطا شود.
استفاده از 2^-ΔΔCt بدون بررسی راندمان
روش کلاسیک ΔΔCt به فرض مناسب بودن راندمان واکنشهای مورد مقایسه وابسته است. در صورت تفاوت قابلتوجه راندمان، روشهای اصلاحشده باید بررسی شوند.
اشتباه گرفتن 0.5 Fold با 2 برابر کاهش
Fold Change برابر 0.5 یعنی بیان ژن به نصف مقدار کنترل رسیده است. میتوان این وضعیت را 2-fold decrease نیز توصیف کرد، اما بهتر است در گزارش علمی عبارت دقیق استفاده شود.
تفسیر Fold Change بدون بررسی آماری
مثلاً Fold Change برابر 1.5 بهتنهایی نشان نمیدهد که افزایش بیان از نظر آماری معنادار است.
جدول سریع تفسیر دلتا دلتا Ct و Fold Change
| ΔΔCt | 2^-ΔΔCt | تفسیر |
|---|---|---|
| -3 | 8 | 8 برابر افزایش |
| -2 | 4 | 4 برابر افزایش |
| -1 | 2 | 2 برابر افزایش |
| 0 | 1 | بدون تغییر نسبی |
| 1 | 0.5 | نصف شدن بیان |
| 2 | 0.25 | یکچهارم شدن بیان |
| 3 | 0.125 | کاهش بیان |
فرمولهای مهم تحلیل Real-Time PCR
فرمول محاسبه دلتا Ct
ΔCt = Ct Target − Ct Reference
فرمول محاسبه دلتا دلتا Ct
ΔΔCt = ΔCt Sample − ΔCt Control
فرمول محاسبه Fold Change
Fold Change = 2^-ΔΔCt
در نتیجه:
Ct → ΔCt → ΔΔCt → 2^-ΔΔCt → Fold Change
آیا هر مقدار دلتا دلتا Ct را میتوان با 2^-ΔΔCt تحلیل کرد؟
خیر. استفاده از 2^-ΔΔCt به کیفیت طراحی آزمایش، انتخاب ژن مرجع و شرایط PCR وابسته است.
اگر راندمان تکثیر ژن هدف و ژن مرجع تفاوت قابلتوجهی داشته باشد، استفاده از روش ساده ΔΔCt ممکن است مقدار تغییر بیان را بهدرستی نشان ندهد. در چنین شرایطی روشهای اصلاحشده بر اساس راندمان میتوانند مناسبتر باشند.
بنابراین 2^-ΔΔCt را نباید یک فرمول مستقل از کیفیت آزمایش در نظر گرفت.
جمعبندی
برای محاسبه دلتا Ct و دلتا دلتا Ct در Real-Time PCR، ابتدا Ct ژن هدف و ژن مرجع را مشخص کنید. سپس با محاسبه ΔCt، مقدار ژن هدف را نسبت به ژن مرجع نرمال کرده و با محاسبه ΔΔCt، نمونه آزمایشی را با نمونه کنترل مقایسه کنید. در نهایت با استفاده از 2^-ΔΔCt مقدار Fold Change به دست میآید.
بهصورت خلاصه:
ΔCt = Ct Target − Ct Reference
ΔΔCt = ΔCt Sample − ΔCt Control
Fold Change = 2^-ΔΔCt
اگر Fold Change بیشتر از 1 باشد، بیان نسبی ژن افزایش یافته و اگر کمتر از 1 باشد، بیان نسبت به کنترل کاهش یافته است.
برای تفسیر قابل اعتماد نتایج نیز باید کیفیت RNA، Reverse Transcription، طراحی پرایمر، اختصاصیت واکنش، راندمان PCR، پایداری ژن مرجع، تکرارهای بیولوژیک و روش آماری مناسب در نظر گرفته شوند.
سوالات متداول
دلتا Ct چیست؟
ΔCt دلتاCt یا اختلاف بین Ct ژن هدف و Ct ژن مرجع در یک نمونه است و برای نرمالسازی بیان ژن استفاده میشود.
دلتا دلتا Ct چیست؟
ΔΔCt دلتا دلتا Ct یا ΔΔCt اختلاف بین ΔCt نمونه آزمایشی و ΔCt نمونه کنترل است و برای مقایسه نسبی بیان ژن بین دو گروه استفاده میشود.
فرمول محاسبه دلتا Ct چیست؟
فرمول آن به شکل زیر است:
ΔCt = Ct ژن هدف − Ct ژن مرجع
فرمول محاسبه دلتادلتا Ct چیست؟
فرمول محاسبه دلتا دلتا Ct عبارت است از:
ΔΔCt = ΔCt نمونه آزمایشی − ΔCt نمونه کنترل
2^-ΔΔCt چه چیزی را نشان میدهد؟
مقدار 2^-ΔΔCt معمولاً بهعنوان Fold Change یا تغییر نسبی بیان ژن نسبت به نمونه کنترل گزارش میشود.
اگر ΔΔCt دلتادلتا Ct منفی باشد، بیان ژن افزایش یافته است؟
در روش 2^-ΔΔCt، ΔΔCt منفی باعث میشود Fold Change بیشتر از 1 شود؛ بنابراین در صورت معتبر بودن شرایط روش، بیان نسبی ژن نسبت به کنترل افزایش یافته است.
اگر ΔΔCt دلتادلتا Ct مثبت باشد، چه اتفاقی میافتد؟
ΔΔCt مثبت باعث میشود مقدار 2^-ΔΔCt کمتر از 1 شود و نشاندهنده کاهش بیان نسبی ژن نسبت به کنترل باشد.
آیا برای محاسبه ΔΔCt دلتادلتا Ct به ژن مرجع نیاز داریم؟
بله. در روش کلاسیک ΔΔCt ابتدا Ct ژن هدف نسبت به یک ژن مرجع نرمال میشود و سپس ΔCt نمونه آزمایشی با نمونه کنترل مقایسه میشود.
آیا Fold Change بهتنهایی نشاندهنده معناداری آماری است؟
خیر. Fold Change میزان تغییر نسبی را نشان میدهد و بهتنهایی معناداری آماری را مشخص نمیکند. برای نتیجهگیری آماری باید تکرارهای بیولوژیک و روش آماری مناسب نیز در نظر گرفته شوند.
