استخراج DNA ژنومی از بافت های ثابت شده با فرمالین و پارافینه
استخراج DNA ژنومی با کیفیت:
آغازین و پیش نیاز علوم زیست شناسی مولکولی ، استخراج DNA ژنومی با کیفیت و غلظت بالا می باشد که نتیجه ی استخراج اسیدنوکلئیک بدون نقص ، منجر به تکثیر DNA به وسیله ی روش های مولکولی مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR) می شود .
بسیاری از عوامل می توانند در فرایند استخراج DNA ژنومی و کسب محصول DNA با کیفیت و خلوص عالی دخیل باشند . از جمله مواردی که در پروسه ی استخراج DNA ، تاثیر گذار هستند می توان به عاری بودن آلودگی به RNA ، لیپید ها ، پروتئین ها اشاره کرد . همچنین کیفیت عالی DNA می تواند به فاکتورهایی وابسته با بعضی از ساختارهای مداخله گر در پلی مرازها و آنزیم های برشی مرتبط باشد . گاهی با توجه به دلایل و شرایط ویژه ای ، محقق می بایست نمونه ی بافت را در شرایط خاصی برای مدت طولانی نگهداری و محافظت کند تا در زمان مورد نظر شروع به انجام فرایند استخراج DNA از نمونه کند .
پارافینه کردن نمونه بافت
یکی از روش های نگهداری نمونه ی بافت در مدت زمان طولانی، تثبیت کردن بافت با فرمالین و پارافینه کردن نمونه است . در واقع پارافینه کردن نمونه ، جهت حفظ و مراقبت در بانک های نگهداری بافت ، یکی از رایج ترین و مهم ترین روش های نگهداری نمونه های کلینیکی به حساب می آید .
اغلب نمونه ها در ابتدا با فرمالین عمل تثبیت در آن ها انجام می شود و سپس در قالب بلوک های پارافین حفظ و نگهداری می شوند . امروزه اهمیت استفاده از این روش بسیار احساس می شود چرا که به پاتولوژیست امکان استفاده از نمونه های بایگانی شده جهت مطالعات گذشته نگر زیست مولکولی را می دهد . بدیهی است با پیشرفت روز افزون علوم ژنتیکی ، در سر تا سر دنیا از روش پارفینه کردن نمونه در آزمایشگاه ها ، بیمارستان ها و مراکز تحقیقاتی استفاده می شود . نمونه های تثبیت شده با فرمالین و یا فیکس شده در پارافین به دلیل اثرات مخرب مواد ثبیت کننده می تواند بر کیفیت مطلوب DNA موثر باشد و با کیت های عمومی نمی توان محصول DNA با کیفیت را داشته باشیم .
کیت استخراج DNA از بافت پارافینه
همان طور که در بالا گفته شد ، بلوک های پارافینه از ماخذ مهم جهت بررسی ، پژوهش و تحقیق در زمینه ی پیشینه های ژنتیکی هستند اما گاهی رپرتاژهایی حاکی از خلوص پایین DNA استخراج شده دریافت می شود که نشان از ضعف کیت های عمومی در این فرایند است . بنابراین شرکت های فعال در زمینه بیولوژی مولکولی ، اقدام به طراحی و توزیع کیت هایی کرده اند که کاربر قادر باشد محصول DNA با غلظت بالا را از نمونه های ثابت شده با فرمالین و پارافینه شده که بیش از پنج سال از عمر آن ها میگذرد را جدا سازی نماید . بدین سبب استفاده از کیت صحیح و کارامد جهت انجام این فرایند بسیار حائز اهمیت است .
کیت استخراج DNA ژنومی از بافت پارافینه کمپانی Favorgen تایوان تمامی عواملی که می تواند در استخراج DNA ژنومی با کیفیت عالی دخیل باشد را در یک مجموعه برای محقق فراهم کرده است . لازم به ذکر است شرکت یکتاتجهیزآزما تنها نماینده انحصاری کمپانی Favorgen تایوان در ایران است که بصورت فعال چندین سال فروش و خدمات پس از فروش محصولات این کمپانی را عهده دار است .
آماده سازی نمونه با پارافین و فرمالین
در ابتدا توجه شما را به توضیح مختصری در مورد آماده سازی نمونه با پارافین و فرمالین جلب می نماییم :
همان طور که گفته شد گاهی با توجه به شرایط خاص محقق و یا پاتولوژیست لازم می بیند که فرایند استخراج را بعد از یک مدت طولانی انجام دهد . برای نگهداری طولانی مدت نمونه ، باید شرایط خاصی در نظر گرفته شود . یکی از روش های رایج و متداول جهت نگهداری نمونه ها ، بلوک های پارافینه می باشد که محاسن خود را دارد . فاکتورهایی ممکن است در طی مطالعه و بررسی ژنتیکی وجود داشته باشد که اسباب و الزام نگهداری نمونه ها را فراهم کند . به عنوان مثال در یک سری از بررسی ها و مطالعات ، به دلیل عواملی من جمله محل خاص نمونه گیری و یا دردناک بودن نمونه گیری برای بیمار و نیز دیگر عوامل مثل پر هزینه بودن و محدودیت های اخلاقی ، دسترسی به نمونه ی تازه بسیار محدود می شود و در این شرایط محقق و یا پاتولوژیست می تواند به بایگانی نمونه های تثبیت شده در پارافین رجوع کند .
برای این شرایط ویژه ، نمونه ی بافت باید با شرایط مخصوصی نگهداری شود بطوریکه ساختارهای داخلی و فاکتورهای ژنتیکی آن نسبت به زمان حیات بدون تغییر باقی بماند و در واقع اسیدنوکلئیک سلول ها بدون تغییر حفظ شود . تهیه و مراحل تثبیت نمونه مراحل متعددی دارد که باید با دقت انجام شود . در ابتدا عمل تثبیت یا فیکساسیون انجام می شود که کشتن هم زمان یاخته های یک بافت است . در حقیقت مواد پروتوپلاسمی نمونه ، بدون تغییر در ساختار آن ها منعقد می شود . مواد ثبیت کننده شامل دو دسته ی مواد آلی و غیز آلی هستند که در بین آنها می توان به اتانول ، استون و فرمالین اشاره کرد . مرحله بعدی در تثبیت نمونه ی بافت شستشو و سپس آب گیری یا دهیدراسیون نمونه است . شستشوی نمونه را می توان با آب جاری انجام داد و آب گیری توسط مواد آب گیرنده انجام میشود که این مرحله توسط الکل طی چندین مرحله و پی در پی صورت می گیرد . سپس مرحله استفاده از پارافین جهت استحکام نمونه است که محیطی پایدار برای نمونه فراهم می کند و برای این مرحله ابتدا پارافین را در حمام آب ذوب کرده و بعد نمونه ها را در سه مرحله داخل آن قرار می دهیم . در مرحله بعدی با استفاده از گلیسرول داخل قالب را چرب کرده و کمی پارافین مذاب داخل آن می ریزیم سپس با استفاده از یک پنس ، نمونه را داخل آن گذاشته و مجدد روی آن را با پارافین می پوشانیم . مرحله ی نهایی در نگهداری نمونه در بلوک های پارافین ، برش گیری است که بوسیله ی دستگاهی به نام میکروتوم انجام می گیرد . به این ترتیت نمونه را می توان برای مدت طولانی نگهداری کرد.
استخراج DNA با خلوص بالا در نمونه های پارافینه
همان طور که در بالا اشاره شد محقق لازم است برای استخراج DNA با خلوص بالا و کیفیت عالی از یک کیت کارآمد و بهینه برای فرایند استخراج DNA از بافت تثبیت شده در پارافین استفاد کند . کمپانی Favorgen تایوان ، کیت استخراج منحصر به نمونه های فیکس شده در پارافین ارائه داده است که تمامی نیاز محقق را تامین می کند . ساختار این کیت ستونی و با غشای سیلیکا ماتریکس است . ارزیابی کمی و کیفی برای روی محصول DNA استخراج شده با استفاده از کیت استخراج DNA از بافت پارافینه حاکی از کیفیت ، کارایی و کارآمدی این محصول نسبت به محصولات مشابه در بازار است . بررسی میزان تکثیر نمونه ها ، نشان دهنده ی غلظت و خلوص DNA استخراج شده با استفاده از این کیت بوده است .
شناسايي موثرترین و کارآمد ترین روش ها در استخراج DNA برای نمونه های پارافینه برای پاتولوژیست جهت بررسی و شناسایی عوامل بیماری زا ، تشخیص پزشکی و مطالعات ژنتیکی بسیار حائز اهمیت است . امروزه با استفاده از متد ستونی استخراج DNA و نیز تنوع محصولی در این زمینه و همچنین محصولات منحصر به هر موضوع ژنتیکی ، مشکلات آنالیز DNA مرتفع شده و در نتیجه تکثیر DNA به وسیله ی روش های مولکولی مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR) بسیار مورد قبول ، شده است و تشخیص پزشکی در مسیر صحیح خود قرار گرفته است .
قبل از شروع به کار با این کیت ، دو ماده زایلین و RNase A را که از ملزومات جانبی کار محسوب می شوند و در کیت فراهم نشده است ، را تهیه کنید . زایلین به عنوان یک حلال جهت پارافین زدایی مورد استفاده قرار می گیرد . توجه داشته باشید که هنگام استفاده از زایلین نکات ایمنی را رعایت کنید تا از آسیب های فیزیکی آن در امان باشید . استفاده از زایلین بدون رعایت کردن نکات ایمنی می تواند منجر به سوزش بینی ، گلو ، سردرد ، عدم تعادل در عضلات ، سرگیجه ، ایجاد مشکلات در سیستم تنفسی و ریه ها و یا تأخیر در واکنش های مربوط به محرك‌های بصری ، مشکلات قلبی و حتی در موارد جدی تر منجر به ایجاد سرطان شود .
استفاده از آنزیم RNase A در این کیت بصورت اختیاری و صرفا برای حذف RNA لازم می باشد .
