آنزیم T4 DNA ligase

آنزیم T4 DNA Ligase

آنزیم T4 DNA Ligase یک آنزیم بسیار کارآمد، دقیق و سریع است که اتصال دو رشته  DNA دوبلکس را کاتالیز می کند.
عملکرد اصلی این آنزیم ایجاد پیوند فسفودی استر بین ‘5-فسفات و ‘3-هیدروکسیل نوکلئوتیدهای مجاور در دو ساختار DNA است. این آنزیم یک DNA با انتهای blunt یا  sticky را به ساختار مکمل پیوند می دهد.
همچنین آنزیم T4 DNA Ligase امکان اتصال RNA را به یک رشته DNA در یک مولکول دوبلکس را فراهم می کند، اما خودش به اسیدهای نوکلئیک تک رشته ای نمی پیوند.
همراه با آنزیم T4 ، یک بافر با غلظت 10x به طور اختصاصی جهت عملکرد بهتر قرارداده شده است.

کاربرد :

• آنزیم T4 DNA لیگاز دو ساختار DNA را بهم متصل میکند.
• در انجام فرآیند کلونینگ موثر است.
• یک ساختار نوترکیب ایجاد می کند.

 موارد استفاده آنزیم T4 DNA Polymerase:

آنزیم T4 DNA Polymerase که از فاژ T4 استخراج می‌شود، به دلیل داشتن فعالیت‌های پلیمراز ۵’→۳’ و اگزونوکلئاز ۳’→۵’، نقش کلیدی در فرآیندهای مولکولی ایفا می‌کند. این آنزیم بیشتر در مراحل آماده‌سازی DNA برای کلونینگ، همسان‌سازی انتهای مولکولی و تولید DNA دو رشته‌ای از DNA تک‌رشته‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد.

از مهم‌ترین کاربردهای آن می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

1. پر کردن انتهای چسبنده (Sticky Ends): این آنزیم با استفاده از فعالیت پلیمراز خود می‌تواند نوکلئوتیدهای مکمل را به انتهای DNA اضافه کرده و آن را دو رشته‌ای کند.

2. حذف نوکلئوتیدهای اضافی از انتهای ۳’: با بهره‌گیری از فعالیت اگزونوکلئازی، T4 DNA Polymerase قادر است نوکلئوتیدهای اضافی را از انتهای ۳’ حذف کرده و انتهاهای صاف (Blunt Ends) ایجاد کند.

3. تبدیل انتهای چسبنده به انتهای صاف: در واکنش‌هایی مانند کلون‌سازی ژنی، آنزیم T4 DNA Polymerase به منظور یکنواخت‌سازی انتهای DNA به‌کار می‌رود تا سازگاری بیشتری در اتصال به وکتور داشته باشد.

4. آماده‌سازی کتابخانه‌های ژنی: در تکنیک‌هایی نظیر Next Generation Sequencing (NGS)، این آنزیم در مرحله‌ی ساخت کتابخانه‌های DNA برای اصلاح انتهاها و افزایش بازدهی اتصال به آداپتورها نقش دارد.

5. برطرف‌سازی شکاف‌های تک‌رشته‌ای در DNA دو رشته‌ای: این آنزیم می‌تواند نواحی شکسته یا ناقص DNA را با پر کردن فاصله‌ها ترمیم کرده و توالی کامل‌تری ایجاد کند.

به طور کلی، T4 DNA Polymerase به دلیل دقت بالا و عملکرد دوگانه، به یکی از ابزارهای اصلی در دستکاری‌های ژنتیکی و مطالعات مولکولی تبدیل شده است