روش های حذف DNase l از نمونه های RNA

همان طور که در مقاله قبل اشاره شد، آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز I و بعبارتی DNase I   یک پلی پپتید تک گلیکوزیله می باشد که DNA تک  رشته ای و دو رشته ای ناخواسته را تجزیه می کند. این آنزیم با تجزیه  DNA به ‘5 فسفودی نوکلئوتید و قطعات الیگونوکلئوتیدی کوچک کار می کند.   DNase I معمولاً به معرف‌های لیز سلولی اضافه می‌شود تا ویسکوزیته ناشی از محتوای DNA در لیزهای سلولی باکتری را حذف کند ، یا الگوهای  DNA  را از  RNAهای تولید شده توسط رونویسی آزمایشگاهی حذف کند. این درجه از  DNase  برای کار پروتئین کافی است.  در روش‌های متداول جداسازی RNA ، عدم وجود DNA ژنومی هنوز یک چالش است. به ویژه برای  واکنش های پایین دست  RT-PCR کمی (qRT-PCR) ، DNA ژنومی ‌تکثیر شده ( درصورت عدم حذف از محتوای RNA استخراج شده ) می‌تواند منجر به نتایج غیراختصاصی شود.

تشخیص DNA ژنومی در نمونه های RNA :

تکنیک های مختلفی برای بررسی  آلودگی RNA توسط DNA ژنومی استفاده شده است. مقادیر زیادی از آلودگی DNA  نمونه ها  را می توان با استفاده از اندازه گیری OD توسط دستگاه نانو دراپ ( به این صورت که نسبت 260/280 نانومتر نمونه ها بسیار کمتر از مقدار بهینه برای RNA که 2 است، می باشد ) ، و یا از طریق الکتروفورز ژل آگارز ( که باند های اسید نوکلئیک با وزن مولکولی بسیار بالا دیده می شوند ) ، شناسایی کرد.

در روش های حساس پایین دستی مانند qRT-PCR ، شناسایی DNA ژنومی  با روش‌های فوق ، قابل تشخیص نیست و در نهایت این آلودگی به DNA می‌تواند باعث نتایج غیراختصاصی گردد. به این صورت که ، هم mRNA رونویسی معکوس (cDNA)  و هم DNA ژنومی ، می توانند به عنوان الگو برای  PCR در نظر گرفته شوند. یک استراتژی برای جلوگیری از این تکثیر مشترک ، طراحی پرایمر PCR است که مرزهای اگزون را در بر می گیرد. این استراتژی طراحی پرایمر ، شامل یک یا چند موتیف های توالی داخلی یا اینترونیک در DNA ژنومی می باشد که بهره وری امپلیفای واکنش PCR را به سمت نمونه cDNA تغییر می‌دهد. ویژگی سنجش qRT-PCR باید با استفاده از واکنش ترانس کریپتاز معکوس بدون در نظر گرفتن واکنش کنترل ، برای تنظیم   qRT-PCR بررسی گردد. این واکنش کنترلی مانند سایر واکنش های qRT-PCR  می باشد ، با این تفاوت که به جای آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ، آب بدون نوکلئاز به مخلوط واکنش اضافه می شود. در صورت مشاهده قطعات PCR تکثیر شده در این واکنش کنترلی ، آلودگی به DNA ژنومی در واکنش اثبات می شود.

با این حساب ، ضرورت حذف DNA ژنومی در نمونه های  RNA استخراج شده برای انجام واکنش های حساس پایین دستی مثل qRT-PCR  احساس می شود. برای این منظور ، استفاده از آنزیم DNase I توصیه می شود. آنزیم DNase I به عنوان یک اندونوکلئاز طبقه بندی می شود که قادر است DNA تک رشته ای و دو رشته ای را به بازها یا الیگونوکلئوتیدها هضم کند. آنزیم اختصاصی  برای تجزیه DNA  که بدون تأثیر منفی بر یکپارچگی RNA مورد استفاده قرار می گیرد.

DNase I یک آنزیم  وابسته به کلسیم است. قدرت یونی بافر واکنش ، عامل دیگری است که می تواند بر فعالیت DNase I تأثیر بگذارد. مانند بسیاری از آنزیم ها ، فعالیت  آنزیم DNase I  هم تحت تأثیر ترکیب بافر واکنش قرار می گیرد. از آنجایی که + Ca2 به طور محکم به DNase I متصل می شود و ترکیب فعال آن را تثبیت می کند، حتی سطوح میکرومولاری +Ca2 می تواند به عنوان یک فعال کننده آنزیم قوی در حضور+ Mg2 عمل کند. DNase I در بافرهای حاوی + Mg2 و +Ca2  فعالیت  بهینه دارد ، اما این بافرها هیچ نمک دیگری ندارند. هنگامی که غلظت نمک (NaCl یا KCl) بافر واکنش استاندارد از 0 به 30 میلی مولار افزایش یابد، فعالیت DNase I بیش از 2 برابر کاهش می یابد.

روش های حذف DNase l  از نمونه های RNA ( بعد از تیمار کردن با آنزیم )  به شرح زیر می باشد:

  • تیمار با پروتئیناز K و به دنبال آن استخراج فنل / کلروفورم : این روش یکی از بهترین روش ها در زمینه حذف آنزیم DNase l می باشد و بسته به کاربرد های پایین دست شما ، یک مرحله فنل / کلروفورم برای حذف تمام آثار آنزیم توصیه می شود. از معایب آن می توان به  زمان بر بودن آن و همچنین احتمال از بین رفتن مقداری از نمونه های RNA درمراحل فنل / کلروفورم اشاره کرد.
  • رسوب کلرید لیتیوم (LiCl )
  • غیر فعال سازی حرارتی : یکی از رایج ترین روش های غیر فعال سازی آنزیم DNase I ، روش حرارتی می باشد. این آنزیم در اثر حرارت دادن در دمای 75 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه غیرفعال می شود. دماهای 95 درجه سانتی گراد به مدت  2 دقیقه و یا 85 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه نیز برای غیر فعال سازی آنزیم پیشنهاد شده است. از معایب این روش می توان به عدم حذف کامل آنزیم DNase l   و درنتیجه اختلال در واکنش های پایین دست اشاره کرد.
  • استفاده از EDTA ( 25 mM) : با افزودن 1 میکرولیتر از EDTA به واکنش های هضم DNase l  و حرارت دادن به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد ، آنزیم  DNase l غیر فعال می شود. در واقع EDTA آنزیم DNase l را غیر فعال نمی کند ، بلکه با حذف یون منیزیم  که کوفاکتور آنزیم می باشد ، باعث غیر فعال شدن آنزیم به دلیل کمبود منیزیم  می گردد. برای غیر فعال شدن آنزیم باید مقدار EDTA بیشتر از +Mg2 باشد تا حذف  به طور کامل صورت پذیرد.
  • تصفیه کردن  RNA : برخی از روش های جداسازی و استخراج  RNA مبتنی بر فیلتر می باشد. استفاده از کیت های مخصوص و ستون های اسپین از جنس سلیکای خاص برای خالص سازی  RNA توصیه می شود که باعث حذف کامل آنزیم DNase l می شود. از معایب این روش هزینه بالای این کیت ها و فیلتر های مخصوص می باشد.

شرکت یکتا تجهیز آزما ، عرضه کننده  آنزیم DNase l   با برند  YTA می باشد. این آنزیم از پانکراس گاوی تهیه شده است و به صورت پودر لیوفیلیزه در مقادیر 10 میلی گرم  (6000unit)  و 100 میلی گرم (60000unit) برای انجام آزمایش های تحقیقاتی  ارائه می گردد. با حل کردن آنزیم DNase l در ( 0.15 مولار) NaCl با غلظت 5 میلی گرم ، آنزیم آماده مصرف می باشد.