تکنیک های PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز یک فناوری بیولوژیکی برای تولید تعداد زیادی کپی DNA است. در این واکنش سه مرحله اصلی درگیر عبارتند از: باز شدن دو رشته از همدیگر، اتصال و گسترش. تکنیک های PCR کاربردهای زیادی در بیولوژی گیاهی، تشخیص بیماری های انسانی، سالمونلا، شبیه سازی، در زمینه دندانپزشکی، میکروبیولوژی، پزشکی قانونی و غیره دارد.

بسیاری از انواع تکنیک های PCR مانند RT-PCR ،touchdown PCR ،Real Time PCR ،Nested PCR ،multiplex PCR  و بسیاری دیگر می باشد که به طور مختصر در مورد انواع مختلف تکنیک های PCR در چند بخش می پردازیم.

انواع مختلف تکنیک های PCR

Multiplex PCR

یک تکنیک بیولوژی مولکولی پرکاربرد است که  جهت بررسی چند ژن در یک واکنش استفاده می شود.

در این راستا چند جفت پرایمر مختلف در یک واکنش به طور همزمان به کار برده می شود. در این نوع PCR به منظور  افزایش بازده واکنش، بهینه سازی  دمای اتصال پرایمر صورت میگیرد و استفاده از سیستم hot-start و بهینه سازی بافر  مورد استفاده در واکنش برای یک PCR موفقیت آمیز multiplex کاملاً ضروری می باشد. در مقایسه با سیستم‌های PCR استاندارد که فقط از 2 پرایمر استفاده می‌کنند، یک چالش دیگر Multiplex PCR،هیبریداسیون متفاوت جفت‌های پرایمر مختلف است. پرایمرهایی که با راندمان بالا متصل می شوند می توانند از اجزای بیشتری از واکنش PCR استفاده کنند و در نتیجه بازده سایر محصولات PCR را کاهش دهند. این امر اغلب منجر به عدم تکثیر برخی ازتوالی های DNA و عدم وجود محصولات PCR مورد انتظار می شود. کیت های PCR تجاری موجود هستند که به طور خاص برای غلبه بر چالش های Multiplex PCR طراحی شده اند و توصیه می شود در صورت امکان از چنین کیتی استفاده شود.

انواع Multiplex PCR

به طور کلی به دو گروه تقسیم می شوند:

• واکنش  PCR با یک الگو: در این تکنیک از یک  نمونه به همراه چند جفت پرایمر به منظور تکثیر و تشخیص مناطق خاصی در نمونه استفاده می شود.

واکنش PCR  با چند الگو: از چندین نمونه و چندین مجموعه پرایمر در یک واکنش استفاده می شود.وجود چند الگوی DNA  منجر به اتصال اشتباه پرایمرها به الگوی اشتباه می شود.

Nested PCR

این نوع PCR برای افزایش ویژگی PCR  به منظور تکثیر ناحیه مورد نظر در DNA الگو  با هدف حذف ناحیه غیراختصاصی تکثیر شده به کمک دو پرایمر دیگر می باشد.

Nested PCR از دو مجموعه پرایمر و دو واکنش متوالی PCR استفاده می کند. اولین مجموعه پرایمرها برای تکثیر یک توالی DNA کمی طولانی تر از توالی مورد نظر طراحی شده است (خارج از محدوده توالی هدف) و پرایمر دوم در محدوده ی تکثیری مربوط به پرایمر اول که  فقط ناحیه ی هدف را تکثیر می کند طراحی می شود. در این تکنیک اول با مجموعه ی اول یک واکنش PCR گذاشته می شود تا ناحیه بزرگتر در اطراف ناحیه هدف  تکثر شود و در مرحله ی بعدی از محصول واکنش اول در واکنش دوم استقاده میشود. بدین ترتیب که در واکنش دوم از محصول واکنش اول به همراه مجموعه دوم پرایمر استفاده میشود و بدین ترتیب الگو در این واکنش ناحیه تکثیری بزرگتر حاصل از مرحله اول می باشد. . در طی واکنش PCR دوم، مجموعه دوم پرایمرها که مخصوص توالی مورد نظر هستند، به آمپلیکون های اولین واکنش PCR  متصل می شوند و منجر به تکثیر توالی مورد نظر می شوند. هدف از این واکنش “Nested PCR”  حذف تکثیرغیر اختصاصی  یک ناحیه ناخواسته  می باشد.

الگو در این واکنش ناحیه تکثیری بزرگتر حاصل از مرحله اول می باشد. . در طی واکنش PCR دوم، مجموعه دوم پرایمرها که مخصوص توالی مورد نظر هستند، به آمپلیکون های اولین واکنش PCR  متصل می شوند و منجر به تکثیر توالی مورد نظر می شوند. هدف از این واکنش “Nested PCR”  حذف تکثیرغیر اختصاصی  یک ناحیه ناخواسته  می باشد.

کلنی PCR

Colony PCR تکنیکی است که برای بررسی حضور یا عدم حضور بخش DNA  مورد نظر که به  پلازمید اضافه و سپس به باکتری منتقل شده است به کار می رود. این یک تکنیک جدید است که به طراحی یک پرایمر خاص برای تکثیر DNA وارد شده به پلاسمید بستگی دارد. از دو نوع پرایمر می توان برای تشخیص DNA وارد شده استفاده کرد، یکی برای تکثیر DNA وارد شده و دیگری برای تکثیر DNA و پلاسمید.

در این روش یک کلنی منفرد انتخاب و مستقیماً به لوله PCR اضافه می شود که این کلنی حامل الگوی DNA است بنابراین در این واکنش الگو  به شکل کلنی در کنار تمام اجزای واکنش PCR قرار می گیر و با PCR سنتی در یک مرحله متفاوت است.  تفاوت این نوع PCR با PCR معمولی  در مرحله استخراج  است ، در روش کلنیPCR  نیازی به استخراج DNA نیست، بلکه باید یک کلنی انتخاب و به یک میکروتیوب یا لوله منتقل کرد  سپس کلنی  را در بافر TE  حل تا سوسپانسیون حاصل شود و بعد به عنوان نمونه DNA به واکنش اضافه کرد یا حتی می توان کلنی را مستقیم به واکنش اضافه و در آن حل کرد. این تکنیک با توان بالا، سریع و مقرون به صرفه است که تنها در صورت وجود ژن مورد نظر/درج DNA/ژن خارجی تکثیر صورت میگیرد. به این معنی که تنها زمانی کار می کند که تغییر  موفقیت آمیز باشد. مزیت اصلی استفاده از کلونی های باکتری به طور مستقیم به عنوان DNA الگو است.

RAPD (Rapid amplified polymorphic DNA analysis):

تکثیر تصادفی پلی مورفیسم DNA (RAP) PCR یکی دیگر از تکنیک های PCR است، مشخصات اصلی این واکنش این است که برای تکثیر الگوی DNA به پرایمر خاصی نیاز ندارد و  از پرایمرهای 10جفت بازی کوتاه برای تکثیر اتفاقی  DNA ژنومی استفاده می شود. در این تکنیک از بیشتر از یک پرایمر استفاده می شود. مراحل انجام RAPD شامل مراحل اصلی زیر می باشد:

• استخراج DNA هدف
• تکثیر مکان های متعدد DNA هدف با استفاده از پرایمرهای انتخابی تصادفی
• ژل الکتروفورز محصولات PCR تکثیر شده
• بررسی ژل و شناسایی پلی مورفیسم

نتیجه به تعداد نوارهای موجود یا غایب روی ژل آگارز پس از PCR بستگی دارد که نشان دهنده پلی مورفیسم DNA در نتیجه جهش یا هرگونه تغییر در توالی DNA است. به دلیل متغیر بودن  اتصال  پرایمرها، قطعات مختلف با طول های مختلف در طول تکثیر تولید می شوند. از این رو، الگوهای نواری روی ژل ها در میان افراد و گونه ها متفاوت است. بنابراین، RAPD تشخیص تنوع ژنتیکی در بین موجودات را امکان پذیر می کند.